Selected Reaction Monitoring (SRM) frente a Western Blot

We propose the SRM technology as a complementary method to the Western Blot for the detection and quantification of proteins in a sample. The technique Western Blot has its own limitations: i) only a protein-of-choice is detected, ignoring any non-relevant proteins, ii) the sensitivity of the technique depends on the specificity of the antibody and iii) Western Blot is expensive and time-consuming. The advantages of SRM with respect Western Blot are remarkable: i) you can detect up to hundreds of different proteins in a sample, ii) SRM is more sensitive, because just 50 copies of the target protein per cell are enough for the detection and iii) once it has been made an investment in the necessary machinery to develop this technique, the detection of proteins in a sample turns into a cheaper, faster, more specific and full-quantitative procedure, without the need of using antibodies. First of all, SRM requires the identification of little peptides, obtained by tryptic digestion, whose sequence must be unique for a single protein or isoform. There is software for that aim. Then, it’s necessary to create isotope-labeled peptides of that identified for acting as internal standards. That sample is introduced in a triple quadrupole mass spectrometer: it passes through a first quadrupole, which functions as a filter, where the fragments are selected, previously ionized, attending to the mass/charge (m/z) relation that correspond to that unique fragments of the protein of interest. In this first selection may be other peptides from other proteins, with the same m/z but with different sequence. To select those that are exclusive from the target protein, the fragments are moved to a second quadrupole, where they are fragmented again with a physical method, and so new smaller fragments are generated. All the new fragments are conduced to the third quadrupole, where just those which come from the protein of interest are selected, attending at their m/z again. The target peptide concentration is determined by measuring the observed signal response for the target peptide relative to that of the isotopic-labeled peptide, the concentration of which is calculated from a pre-determined calibration-response curve. Calibration curves have to be generated for each target peptide in the sample. Because SRM technology is increasing its use, there have been developed databases where the scientific community upload information about protocols and standards for each protein with the aim to facilitate the work to other researchers

Descifrando el rol de la biopelícula de dos especies de Pseudomonas asociadas a plantas

Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.Pseudomonas syringae es una especie bacteriana que produce enfermedades en la parte aérea de plantas tanto herbáceas como leñosas. Por otro lado, Pseudomonas chlororaphis interacciona con la raíz de la planta y es un agente de control biológico de enfermedades fúngicas en árboles de aguacate y plantas de tomate. Ambas especies bacterianas forman biopelícula y, a pesar de su diferente estilo de vida (epífito-patógeno y rizosfera - agente de biocontrol), están relacionadas filogenéticamente. Pensamos que, debido a esta relación filogenética, ambas bacterias deben contener componentes comunes y diferenciales en la matriz extracelular de la biopelícula que podrían tener un papel importante en la interacción con el huésped vegetal. Análisis in silico han mostrado que ambas presentan algunas regiones genómicas comunes y otras diferenciales que podrían codificar para proteínas implicadas en la síntesis de componentes de la matriz extracelular. Hemos construido mutantes de estas regiones y analizado su implicación en diferentes aspectos relacionados con la formación de biopelícula. Estos componentes podrían tener un papel importante en la interacción con el huésped.Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía (Spain) con referencia P12-AGR-1473 y el Proyecto del Plan Nacional I+D+I del Ministerio de Economía (MINECO, Spain) con referencia AGL2014-52518-C2-IR, y la Universidad de Málaga. Zaira María Heredia está financiada por una beca de doctorado del programa FPU del Ministerio de Educación (referencia FPU15/03644)

La matriz extracelular de la biopelícula en la ecología de dos especies de Pseudomonas asociadas a plantas

Por un lado, la reducción de la formación de biopelícula en la cepa mutante en Psl de PssUMAF0158 incrementa la virulencia en foliolos de tomate, tal y como se había descrito previamente para el polisacárido celulosa. Por otro lado, la reducción de la formación de biopelícula en la cepa mutante en Psl de PcPCL1606 tiene un impacto negativo sobre la efectividad de la actividad de biocontrol frente a la podredumbre blanca radicular del aguacate causada por el hongo fitopatógeno Rosellinia necatrix. La fibra de tipo amiloide Fap, la cual es producida por PcPCL1606 pero no por PssUMAF0158, no posee un papel relevante en la formación de biopelículas in vitro, pero sí ha mostrado tener un papel en adhesión temprana a superficies de tipo abiótico y biótico y en la eficacia de la actividad de control biológico en el sistema mencionado. Adicionalmente, en esta tesis doctoral se ha demostrado que la temperatura y la luz influyen en la producción de polisacáridos en las cepas de P. syringae pv. syringae y, por lo tanto, que esta bacteria puede modular la formación de biopelículas en respuesta a factores ambientales.La formación de biopelículas ha mostrado ser una característica relevante de la bacteria fitopatógena Pseudomonas syringae pv. syringae y del agente de control biológico Pseudomonas chlororaphis durante la interacción con plantas. Un análisis genómico comparativo reveló que los polisacáridos alginato y Psl, así como la fibra de tipo amiloide Fap, relevantes para la formación de biopelículas en otras Pseudomonas, podrían ser componentes de la matriz extracelular de Pseudomonas syringae pv. syringae UMAF0158 (PssUMAF0158), agente causal de la necrosis apical del mango, y/o del agente de biocontrol Pseudomonas chlororaphis PCL1606 (PcPCL1606). A diferencia del polisacárido alginato, el polisacárido Psl sólo ha sido estudiado en Pseudomonas aeruginosa, a pesar de que la región genómica que lo codifica está presente en varias cepas de pseudomonas asociadas a plantas, incluidas PssUMAF0158 y PcPCL1606. Los resultados obtenidos han mostrado que el polisacárido alginato no desempeña un papel esencial para la formación de biopelículas en estos dos modelos de estudio, como se había descrito previamente en P. aeruginosa. El clúster génico de tipo psl de la cepa PssUMAF0158 está presente en todos los filogrupos del complejo P. syringae que están asociados a plantas. Sin embargo, la presencia del clúster génico de tipo psl de la cepa PcPCL1606 dentro del complejo Pseudomonas fluorescens es más variable, aunque está presente en todas las cepas del filogrupo P. chlororaphis que se han analizado. Estudios de formación de biopelículas y virulencia en PssUMAF0158 y de formación de biopelículas y actividad de biocontrol en PcPCL1606 con las cepas silvestres y mutantes afectados en la producción de Psl han revelado que este polisacárido es un componente de la matriz extracelular de estas cepas con un papel importante para la formación de biopelículas y la ecología bacteriana

The biofilm formed by Pseudomonas species associated with plants. Two models: P. chlororaphis in the rhizosphere and P. syringae in the phyllosphere.

Comunicación a congreso en forma de pósterPseudomonas syringae is a bacterium which produces diseases in aerial parts of both herbaceous and woody plants. Otherwise, Pseudomonas chlororaphis interacts with the plant rhizosphere and is a biocontrol agent of plant fungal diseases. Both these bacterial species form biofilms and, despite their different life style (epiphyte-pathogen and rhizosphere-biocontrol agent), they are closely related in phylogenetic analyses. We think that because of this relatedness, they must contain some common and different components in the biofilm matrix, which may basically reflect the different lifestyle that these bacteria have while interacting with their host. Analysis in silico have showed some common and different regions that may codify proteins as candidates for producing biofilm-matrix components. We have constructed mutants of these regions and analysed their implications in aspects related to biofilm formation. These regions may reflect the different lifestyle between these two-bacterial species.This work is supported by Proyecto de Excelencia de la Junta de Andalucía (Spain) P12-AGR-1473 and Plan Nacional I+D+I from Ministerio de Economía (MINECO, Spain) AGL2014-52518-C2-IR. Zaira María Heredia is supported by a PhD Fellowship from the Spanish FPU program (FPU15/03644 reference code). Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tec