Characterization of an Arabidopsis thaliana mutant in the At4g25290 gene coding for putative photolyase. Response to high temperature stress.

Gen At4g25290 koduje bardzo słabo scharakteryzowane białko, którego fizjologiczna funkcja nie została jeszcze potwierdzona. At4g25290 jako potencjalna fotoliaza DNA klasyfikowana jest do rodziny białek CPF (cryptochrome/photolyase family). Rodzina ta obejmuje wiele różnych klas białek, których cechą wspólną jest zdolność do absorpcji w zakresie bliskiego UV i VIS. Dotychczasowe badania mające na celu scharakteryzowanie At4g25290, przeprowadzone w Zakładzie Biotechnologii Roślin, pozwoliły na stwierdzenie, że białko to kolokalizuje z nukleoidem chloroplastowym. Ponieważ wiele białek związanych z DNA chloroplastowym wpływa na wrażliwość roślin na stresy abiotyczne, w tym stres związany z wysoką temperaturą, postanowiono sprawdzić czy At4g25290 też pełni taką rolę.W celu zbadania potencjalnego zaangażowania At4g25290 w odpowiedź na stres temperaturowy sprawdzono wpływ 2 godzinnej inkubacji w 40oC na ekspresję genu At4g25290, system korzeniowy młodych siewek oraz kwitnienie u Arabidopsis thaliana. Test GUS pozwolił na zobrazowanie zmniejszonej aktywności promotora At4g25290 po zadziałaniu temperaturowego czynnika stresowego oraz pokazanie, że w młodych siewkach promotor At4g25290 aktywny jest tylko w liścieniach. Pomiary średniej długości systemu korzeniowego siewek i indukcji kwitnienia wykazały brak obserwowalnych różnic fenotypowych w badanym okresie. Natomiast oznaczenie ilości transkryptu At4g25290 metodą Real-Time PCR pozwoliło na stwierdzenie, iż w siewkach poddanych szokowi cieplnemu w 40oC, pomimo przebywania w ciemności, po godzinie od inkubacji wzrósł poziom mRNA At4g25290. Pozwala to przypuszczać, iż temperatura może być czynnikiem wpływającym na poziom ekspresji At4g25290.At4g25290 gene encodes a very poorly characterized protein whose physiological function has not yet been confirmed. At4g25290 as a putative DNA photolyase is classified as a member of CPF (cryptochrome / photolyase family). The family includes many different classes of proteins whose common feature is the ability to absorb in the near-UV and VIS range. Previous studies to characterize At4g25290, performed at the Department of Plant Biotechnology, allowed to state that the protein is colocalized with chloroplast nucleoid. Because many proteins associated with chloroplast DNA affect the sensitivity of plants to abiotic stresses, including stress related to high temperature, it was decided to check whether At4g25290 also plays such a role.In order to investigate the potential involvement of At4g25290 in response to temperature stress, the effect of a 2-hour incubation at 40°C on At4g25290 gene expression, root system of young seedlings and flowering in Arabidopsis thaliana was tested. The GUS staining allowed the visualization of decreased activity of the At4g25290 promoter after heat shock and showed that in young seedlings the At4g25290 promoter is active only in cotyledons. Measurements of the seedling root system and flowering induction didn’t revealed any phenotypic traits during the studied period. However, the levels of At4g25290 transcript measured with Real-Time PCR were higher in seedlings one hour after a heat shock at 40oC, despite being in the dark. This allowed us to assume that the high temperature could be a factor regulating the At4g25290 expression level

Optimisation of the Microbial Soil Community Analysis Methods for Forensics Purposes

Wszechobecność oraz łatwość nieświadomego przeniesienia materiału sprawiają, że gleba jest interesującym przedmiotem badań kryminalistycznych. Obecne badania w tym zakresie koncentrują się na wykorzystaniu biologicznej frakcji tego materiału, który dzięki zastosowaniu nowych technologii pozwala na porównywanie całych społeczności organizmów zamieszkujących dane środowisko, a nie jak dotąd poszczególnych gatunków. Główny nacisk w badaniach nad mikrobiomem gleby kładziony jest obecnie na techniki pozwalające zwiększyć moc dyskryminacyjną analiz bioróżnorodności w glebach pochodzących z regionów różniących się szerokością geograficzną.Podstawowym celem niniejszej pracy było opracowanie planu postępowania z próbkami mikrobiomu glebowego, począwszy od etapu izolacji DNA, do wstępnej analizy wykrytej różnorodności metagenomu. W celu realizacji założeń pracy wybrano optymalny zestaw do ekstrakcji DNA z próbek gleby, porównano wydajności izolacji osiągane dzięki 3 różnym dostępnym na rynku homogenizatorom i zbadano wpływ etapu homogenizacji na otrzymywany profil genetyczny społeczności mikroorganizmów w badanych glebach.Przeprowadzone badania pozwoliły na wytypowanie systemowego rozwiązania: zestawu ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA i stacji pipetującej Tecan Freedom EVO, jako optymalnej metody ekstrakcji DNA z próbek gleby. Jako metodę homogenizacji pozwalającą na uzyskanie największej wydajność podczas ekstrakcji DNA wybrano wytrząsarkę Vortex-Genie 2. Nie udało się określić ostatecznego wpływu metody homogenizacji na wykrywaną różnorodność genetyczną mikrobiomu glebowego. Zaobserwowano znaczący wpływ metody sekwencjonowania na obserwowany profil społeczności mikroorganizmów. Wyniki niniejszej pracy wskazują na konieczność postepowania według jednolitego protokołu w celu umożliwienia analizy porównanwczej mikrobiomu glebowego w kontekście kryminalistycznym.The ubiquity and the ease of unconscious transfer make soil an interesting subject for forensic research. The current research in this area focuses on the use of the biological fraction of this material, which, thanks to the use of new technologies, allows the comparison of entire communities of organisms inhabiting a given environment, not only individual species as before. In soil microbiome research, the main emphasis is now on techniques that can increase the discriminatory power of biodiversity analysis in soils from regions of different latitude.The main goal of this study was to develop a plan for dealing with soil microbiome samples, from the DNA isolation stage to the initial analysis of the detected metagenome diversity. In order to achieve the goal of the study, the optimal kit for DNA extraction from soil samples was selected, the isolation efficiency achieved thanks to three different homogenizers available on the market was compared and the influence of the homogenization step on the obtained genetic profile of the microbial community in the studied soils was examined.The conducted research allowed the selection of the ZymoBIOMICS 96 MagBead DNA kit and the Tecan Freedom EVO pipetting station as the optimal method of DNA extraction from soil samples. The Vortex-Genie 2 shaker was chosen as the method of homogenization allowing for the highest efficiency of DNA extraction. The final effect of the homogenization method on the detected genetic diversity of the soil microbiome was not determined. A significant effect of the sequencing method on the observed profile of the microbial community was observed. The results of this study indicate the need to follow a uniform protocol in order to enable the analysis of the soil microbiome in a forensic context

Harnessing the potential of the environmental microbiome in forensic science

Konsorcjum naukowe pod przewodnictwem Centralnego Laboratorium Kryminalistycznego Policji podjęło się opracowania metody analizy DNA mikrobiomu gleby, która znajdzie zastosowanie w badaniach kryminalistycznych. Celem projektu o akronimie SMAFT (Soil Microbiome Analysis Forensic Tool, http://smaft.eu/), finansowanego przez Narodowe Centrum Badań i Rozwoju (DOB-BIO10/03/01/2019), jest stworzenie nowego narzędzia umożliwiającego powiązanie śladu w postaci próbki gleby z określoną lokalizacją geograficzną. W pierwszej części artykułu przybliżono pojęcie mikrobiomu oraz przedstawiono możliwości wykorzystania analiz DNA mikrobiomu w kryminalistyce. W jego drugiej części szczegółowo opisano etapy realizowanego projektu, począwszy od zbierania próbek gleby z różnych miejsc Polski w czterech porach roku i izolacji z nich DNA mikrobiomów, poprzez oparte na technologii MPS (ang. Massively Parallel Sequencing) sekwencjonowanie izolatów oraz opracowanie testu genetycznego zawierającego zestaw markerów metagenomicznych pozwalających na skuteczną indywidualizację próbek gleby, aż po stworzenie systemu informatycznego umożliwiającego analizę i interpretację otrzymanych wyników, który obejmuje bazę danych profili DNA mikrobiomów gleb pochodzących z różnych miejsc Polski.A scientific consortium led by the Central Forensic Laboratory of the Police has undertaken to develop a method for DNA analysis of the soil microbiome to be used in forensic investigations. The aim of the project entitled Soil Microbiome Analysis Forensic Tool – SMAFT (http://smaft.eu/), financed by the National Center for Research and Development (DOB-BIO10/03/01/2019), is to develop a new tool that enables the association of a trace in the form of a soil sample with a specific geographical location. The first part of the paper introduces the concept of the microbiome and presents the possibilities of using microbiome DNA analysis in forensic science. In the second part, the stages of the SMAFT project are described in detail, beginning from the collection of soil samples from different sites in Poland across all seasons and isolation of microbiome DNA through massively parallel sequencing (MPS) technology-based analysis of isolates and the development of a genetic test containing a set of metagenomic markers allowing for effective individualization of soil samples, up to the creation of an IT system enabling analysis and interpretation of the obtained results, which includes a database of soil microbiome DNA profiles from various locations in Poland