Künstlich gespaltene Inteine für die Protein-Semisynthese - Charakterisierung des Ssp DnaB Inteins und Modifikation des Ionenkanals OmpF mit Hilfe des Psp-GBD Pol Inteins

Gespaltene Inteine sind leistungsfähige Werkzeuge zur Knüpfung nativer Peptidbindungen zwischen Polypeptidsequenzen. Die von ihnen vermittelte Protein trans-Splei߬reaktion beginnt zunächst mit der Assoziation der Fragmente des gespaltenen Inteins, die Teile von zwei separaten Fusionsproteinen sind. Der gebildete spleißkompetente Inteinkomplex schnei¬det sich anschließend aus dem Vorläufer¬protein heraus und verbindet dabei die fusionierten Polypeptidsequenzen (N- und C Extein) mit¬ein¬ander. Die Spezifität der Inteinassoziation verleiht dieser Ligations¬reaktion einen höchst chemo¬selektiven Charakter. Neben einigen natürlich vorkommenden Vertretern gewinnt die wachsende Zahl der auf künstliche Weise gespaltenen Inteine immer mehr an Bedeutung. Zur Erweiterung der Anwendungsbreite der Protein trans-Spleißreaktion wurde das Ssp DnaB Intein, dessen N und C terminalen Spleißbereiche nach Position 104 gespalten und von der integrierten Endo¬nuclease¬domäne befreit worden waren, in gereinigter Form und unter nativen Reaktions¬bedingungen charakterisiert. Die Abhängigkeit der Spleißaktivität von einer forcierten Assoziation mit Hilfe der durch Rapa¬mycin induzierten Hetero¬dimeri¬sierung der fusionierten FKBP- und FRB-Domänen stand im Fokus der Unter¬suchung¬en. Dabei zeigte sich, dass die Intein¬frag¬mente selbst bereits eine ausgeprägte Affinität besaßen, die eine spontan ein¬setzende Protein trans-Spleißreaktion auch ohne induzierte Dimerisierung ermöglichte. Eine kinetische Analyse belegte zudem, dass die FKBP- und FRB-Assoziation weder auf die Reaktions¬geschwindigkeit noch auf die Ausbeute der Protein trans-Spleißreaktion einen positiven Effekt ausübte. Damit stellte das Ssp DnaB Intein das erste artifiziell gespaltene Intein mit spontaner Spleißaktivität dar, das in vitro keine denaturierende Präparation und anschließende gemeinsame Renaturierung der Inteinfragmente benötigte. Auf diese Weise wurden Anwendungen unter vollständig nativen Bedingungen zur Bewahrung der Aktivität nicht rückfaltbarer Proteine zugänglich. Ein Vergleich mit der Protein trans-Spleißreaktion des Sce VMA Inteins, für die eine induzierte Dimerisierung essentiell war, offenbarte ein ähnliches kinetisches Potential. Allerdings wurde für diese Reaktion ein biphasischer Verlauf beobachtet, der auf eine komplexere Kopplung der einzelnen Reaktions¬schritte hinwies. Eine weitergehende Anwendung der Protein trans-Spleißreaktion konnte durch die Protein-Semi¬synthese des Porins OmpF, das in die äußere Membran von E. coli integriert ist, durchgeführt werden. Der 340 Aminosäuren umfassende Ionenkanal wurde zunächst mit Hilfe des künstlich gespaltenen Psp-GBD Pol Inteins aus zwei rekombinant hergestellten und in 6 M Harnstoff solubilisierten Fragmenten wieder¬her¬ge¬stellt. Durch Rückfaltung konnte der trimere Kanal mit nativer Amino¬säure¬sequenz rekonstituiert werden. Elektrophysiologische Untersuchungen in einer planaren Lipiddoppelschicht (Black Lipid Membrane) belegten, dass auf diese Weise OmpF-Kanäle mit natürlicher Aktivität erhalten werden konnten. Darauf aufbauend wurde eine Strategie zur Herstellung eines semisynthetischen Porins entwickelt, die eine Kombination aus Cystein-Konjugation, Protein trans-Spleißen und Rückfaltung enthielt. Nach dem Einführen von Cysteinresten in die N- und C-terminalen OmpF-Fragmente sowie der Konstruktion einer Cystein-freien Mutante des Psp-GBD Pol Inteins konnte ein Benzo-18-Krone-6-Baustein durch Cystein-Konjugation (K16C) mit dem N-terminalen OmpF-Frag¬ment verknüpft werden. Durch Protein trans-Spleißen wurde die Sequenz des OmpF-Derivats zusammen¬gefügt und nach Rückfaltung der semisynthetische Ionenkanal mit trimerer Struktur erhalten. Der im Lumen der OmpF-Pore präsentierte Kronenether führte zu einem verrin¬gerten Leitwert des Ionenkanals. Diese Reaktionssequenz ermöglicht die chemo- und regio¬se¬lek¬tive Cystein-Konjugation innerhalb eines Fragments unabhängig von weiteren Cystein¬resten in der komplementären Sequenz. Dies kann in Verbindung mit der Click-Reaktion als Ausgangspunkt für vielfältige weiterführende Protein Engineering An¬wen¬dungen genutzt werden. Zusammen¬fassend konnten in dieser Arbeit neue Ansätze etabliert werden, die das Potential von gespaltenen Inteinen für die selektive chemische Modifikation von Proteinen demonst¬rieren und erweitern

Entwicklung einer neuen Methode zur chemo- und regioselektiven Cys-tag Modifikation von Proteinen mithilfe von gespaltenen Inteinen

Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die Selektivität des Einbaus in ein Zielprotein, wobei generell die strukturelle und funktionelle Integrität des zu untersuchenden Proteins durch die Modifikation erhalten bleiben soll. Traditionelle Biokonjugationstechniken bedienen sich beispielsweise häufig der Cysteinseitenkette, die aufgrund der einzigartigen chemischen Reaktivität der Thiolgruppe und des relativ geringen natürlichen Vorkommens in Proteinen ein geeignetes Ziel für Modifikationsreaktionen darstellt. Die Cysteinmodifikation mit verschiedenen funktionellen Gruppen verläuft jedoch nur in Proteinen mit einem einzigen Cysteinrest streng regioselektiv und kann deshalb für Proteine mit essentiellen oder mit mehreren Cysteinresten nur eingeschränkt oder gar nicht angewendet werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die dieses Problem der Regioselektivität in einer zweistufigen Reaktion durch Verwendung eines gespaltenen Inteins umgeht. Dabei wird in einem ersten Schritt zunächst ein Fusionsprotein, bestehend aus einem C-terminalen Inteinfragment und einer kurzen C-terminalen Exteinsequenz, mit einem einzelnen Cystein (Cys-tag) durch ein Thiol-spezifisches Reagenz mit der gewünschten Gruppe regioselektiv modifiziert. In einem zweiten Schritt wird dieser modifizierte Cys-tag mittels trans-Proteinspleißen über eine stabile Peptidbindung mit einem beliebigen Zielprotein, das als Fusion mit dem komplementären N-terminalen Inteinfragment hergestellt wird, verbunden. Dadurch, dass die Modifikationsreaktion getrennt von der Proteinspleißreaktion abläuft, bleiben Cysteinreste im Zielprotein durch diese Prozedur unbeeinflusst. Eine wichtige Voraussetzung für diese Technik ist die Verfügbarkeit von gespaltenen Inteinen mit mindestens einem Cystein-freien Inteinfragment. In dieser Arbeit wurde dazu zunächst das künstlich gespaltene Ssp DnaB Intein verwendet, das gute Spleißausbeuten in zeit- und temperaturabhängigen Spleißreaktionen liefert. Durch das Einführen eines Cysteinrestes in eine kurze C-Exteinsequenz konnte ein Cys-tag generiert werden, der sowohl mit verschiedenen Fluorophoren, als auch mit Biotin regioselektiv modifiziert werden konnte und die nachfolgende Spleißreaktion nicht beeinträchtigte. Auch die Cystein-haltigen Proteine β-Laktamase und Thioredoxin, konnten als Fusionsproteine mit dem N-terminalen DnaB Inteinfragment produziert und mit dem Cys-tag regioselektiv modifiziert werden. Ihre enzymatische Aktivität wurde dadurch nicht beeinflusst. Die spontane Bildung des aktiven Inteins aus den beiden komplementären Inteinhälften konnte ferner für die Modifikation eines ungereinigten Zielproteins in einem Zelllysat ausgenutzt werden. In einer Weiterentwicklung dieser Methode konnte erstmals ein trans-spleißendes Intein aus dem Mxe GyrA Mini-Intein generiert und biochemisch charakterisiert werden. Die Spleißproduktbildung des gespaltenen GyrA Inteins verlief dabei im Vergleich zum zuvor verwendeten DnaB Intein zwar etwas langsamer, dafür aber mit deutlich besseren Ausbeuten. Für die C-terminale Cys-tag Modifikation von Proteinen konnten sowohl Fluorophore als auch Polyethylenglykol eingesetzt werden. Die Herstellung von regioselektiv Fluorescein-modifiziertem menschlichem Wachstumshormon gelang durch die Kombination aus der Cys-tag Technik mit einem Rückfaltungsprotokoll. In einem weiteren Beispiel konnte auch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase TycA regioselektiv mit Fluorescein modifiziert und anschließend gereinigt werden. Modifiziertes TycA zeigte in einem Produktbildungsassay unveränderte enzymatische Aktivität, verglichen mit einem vollständig rekombinant hergestellten TycA-Kontrollprotein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden verwendeten gespaltenen Ssp DnaB und Mxe GyrA Inteine orthogonal zueinander sind, d.h. beide Inteine bildeten unabhängig voneinander Spleißprodukt

Entwicklung einer neuen Methode zur chemo- und regioselektiven Cys-tag Modifikation von Proteinen mithilfe von gespaltenen Inteinen

Die chemo- und regioselektive Modifikation von Proteinen mit diversen biophysikalischen funktionellen Gruppen ist von zentraler Bedeutung in der biochemischen Forschung. Alle zu diesem Zweck entwickelten Methoden unterscheiden sich prinzipiell durch die Natur der biophysikalischen Gruppe, oder die Selektivität des Einbaus in ein Zielprotein, wobei generell die strukturelle und funktionelle Integrität des zu untersuchenden Proteins durch die Modifikation erhalten bleiben soll. Traditionelle Biokonjugationstechniken bedienen sich beispielsweise häufig der Cysteinseitenkette, die aufgrund der einzigartigen chemischen Reaktivität der Thiolgruppe und des relativ geringen natürlichen Vorkommens in Proteinen ein geeignetes Ziel für Modifikationsreaktionen darstellt. Die Cysteinmodifikation mit verschiedenen funktionellen Gruppen verläuft jedoch nur in Proteinen mit einem einzigen Cysteinrest streng regioselektiv und kann deshalb für Proteine mit essentiellen oder mit mehreren Cysteinresten nur eingeschränkt oder gar nicht angewendet werden. In dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die dieses Problem der Regioselektivität in einer zweistufigen Reaktion durch Verwendung eines gespaltenen Inteins umgeht. Dabei wird in einem ersten Schritt zunächst ein Fusionsprotein, bestehend aus einem C-terminalen Inteinfragment und einer kurzen C-terminalen Exteinsequenz, mit einem einzelnen Cystein (Cys-tag) durch ein Thiol-spezifisches Reagenz mit der gewünschten Gruppe regioselektiv modifiziert. In einem zweiten Schritt wird dieser modifizierte Cys-tag mittels trans-Proteinspleißen über eine stabile Peptidbindung mit einem beliebigen Zielprotein, das als Fusion mit dem komplementären N-terminalen Inteinfragment hergestellt wird, verbunden. Dadurch, dass die Modifikationsreaktion getrennt von der Proteinspleißreaktion abläuft, bleiben Cysteinreste im Zielprotein durch diese Prozedur unbeeinflusst. Eine wichtige Voraussetzung für diese Technik ist die Verfügbarkeit von gespaltenen Inteinen mit mindestens einem Cystein-freien Inteinfragment. In dieser Arbeit wurde dazu zunächst das künstlich gespaltene Ssp DnaB Intein verwendet, das gute Spleißausbeuten in zeit- und temperaturabhängigen Spleißreaktionen liefert. Durch das Einführen eines Cysteinrestes in eine kurze C-Exteinsequenz konnte ein Cys-tag generiert werden, der sowohl mit verschiedenen Fluorophoren, als auch mit Biotin regioselektiv modifiziert werden konnte und die nachfolgende Spleißreaktion nicht beeinträchtigte. Auch die Cystein-haltigen Proteine β-Laktamase und Thioredoxin, konnten als Fusionsproteine mit dem N-terminalen DnaB Inteinfragment produziert und mit dem Cys-tag regioselektiv modifiziert werden. Ihre enzymatische Aktivität wurde dadurch nicht beeinflusst. Die spontane Bildung des aktiven Inteins aus den beiden komplementären Inteinhälften konnte ferner für die Modifikation eines ungereinigten Zielproteins in einem Zelllysat ausgenutzt werden. In einer Weiterentwicklung dieser Methode konnte erstmals ein trans-spleißendes Intein aus dem Mxe GyrA Mini-Intein generiert und biochemisch charakterisiert werden. Die Spleißproduktbildung des gespaltenen GyrA Inteins verlief dabei im Vergleich zum zuvor verwendeten DnaB Intein zwar etwas langsamer, dafür aber mit deutlich besseren Ausbeuten. Für die C-terminale Cys-tag Modifikation von Proteinen konnten sowohl Fluorophore als auch Polyethylenglykol eingesetzt werden. Die Herstellung von regioselektiv Fluorescein-modifiziertem menschlichem Wachstumshormon gelang durch die Kombination aus der Cys-tag Technik mit einem Rückfaltungsprotokoll. In einem weiteren Beispiel konnte auch die nicht-ribosomale Peptidsynthetase TycA regioselektiv mit Fluorescein modifiziert und anschließend gereinigt werden. Modifiziertes TycA zeigte in einem Produktbildungsassay unveränderte enzymatische Aktivität, verglichen mit einem vollständig rekombinant hergestellten TycA-Kontrollprotein. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die beiden verwendeten gespaltenen Ssp DnaB und Mxe GyrA Inteine orthogonal zueinander sind, d.h. beide Inteine bildeten unabhängig voneinander Spleißprodukt

Gerichtete Proteinevolution als Werkzeug zur Generierung funktionell und strukturell neuartiger Proteine

Proteine mit neuartiger oder verbesserter Funktionalität sind in der Industrie und der Grundlagenforschung von großem Interesse. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden zwei Verfahren der gerichteten Proteinevolution, das Hefe-2-Hybridsystem und das Phagen-Display, verwendet und auf die Anforderungen für zwei unterschiedliche Proteine adaptiert. Im ersten Projekt sollte ein neuer Ansatz zur Generierung eines mit organischen Molekülen schaltbaren Proteins entwickelt werden. Die Bindestelle des Effektormoleküls sollte de novo im hydrophoben Kern des Modellproteins, der SH3-Domäne der c-Abl Tyrosinkinase, evolviert werden. Dazu wurde in einem ersten Schritt die kleine Aminosäure Ala4 des hydrophoben Kerns durch die sterisch anspruchsvollen Aminosäuren Val und Phe ersetzt. Nach Anpassung der Proteinfaltung durch geeignete Mutationen sollten diese Platzhalter nach Rückmutation eine Kavität für das Effektormolekül hinterlassen. Während die Val-Mutation toleriert wurde und biochemisch durch CD-Spektroskopie und in der Ligandenbindung charakterisiert werden konnte, bewirkte die Phe-Mutation offensichtlich eine Entfaltung der SH3-Domäne. Mit dem Hefe-2-Hybridsystem als Selektionsmethode wurde ein Ansatz entwickelt, um durch Proteinevolution kompensierende Mutationen zu identifizieren, die erneut zu einer stabilen Proteinfaltung führen. Es wurden Fusionskonstrukte aus der DNA-Bindedomäne LexA und der B42-Aktivatordomäne mit dem Peptidliganden und der SH3-Domäne hergestellt, sodass eine Interaktion die Transkription der Reportergene LEU2 und lacZ bewirkte. Von der SH3-Domäne wurden auf DNA-Ebene Bibliotheken hergestellt, die entweder durch epPCR oder durch Zufallsmutagenese von fünf Aminosäuren des hydrophoben Kerns (L16, I18, L24, V47 und I52) mittels einer rekursiven PCR gewonnen wurden. Nach der genetischen Selektion erhaltene Hefekolonien wurden als Kandidaten weiter untersucht. Dabei wurde in hohem Maße das Auftreten von falsch Positiven beobachtet, sodass eine Umorganisation des hydrophoben Kerns nicht erreicht werden konnte. Im zweiten Projekt wurde erstmals ein auf Phagen-Display beruhendes Selektionsschema für die Verbesserung von gespaltenen Inteinen entwickelt. Inteine sind interne Proteine, die sich aus einem Vorläuferprotein unter Verknüpfung der flankierenden Polypeptidketten (N- und C-Extein) autokatalytisch entfernen. Diese Reaktion wird als Proteinspleißen bezeichnet. In gespaltenen Inteinen müssen zunächst das N- und das C-terminale Inteinfragment (IntN bzw. IntC) assoziieren. In dieser Arbeit wurde mit dem künstlich an Position 11 sowie Position 104 gespaltenen DnaB-Intein aus Synecchocystis sp. PCC6803 gearbeitet. Mit erstgenanntem System ließe sich in Zukunft auch der Einbau eines organischer Bausteins anstelle der sterisch anspruchsvollen proteinogenen Aminosäure (vergl. Ala4Phe) im ersten Projekt realisieren. Ein IntN(104)-Fusionsprotein wurde mit dem M13-Phagen, der das komplementäre IntC-Fragment präsentierte, inkubiert und die Spleißreaktion durch Immunoblotting nachgewiesen. Anschließend wurde das IntN(104)-Fusionsprotein durch ein N-terminales Streptavidin-bindendes Peptid (SBP) an Streptavidin-Beads immobilisiert. Die aus der Spleißreaktion resultierenden SBP-Phagenpartikel konnten kompetitiv mit Biotin eluiert werden. Mit diesem Protokoll gelang es, aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen den Hybridphagen über fünf Selektionszyklen um den Faktor 1250 anzureichern. Für das an Position 11 gespaltene DnaB-Intein konnte ebenfalls durch Präsentation des IntC(11)-Fusionsproteins auf der Phagenoberfläche und Inkubation mit einem synthetischen IntN(11)-Fusionspeptid die Modifikation des Phagenproteins durch Protein-Spleißen gezeigt werden. Dabei wurde Desthiobiotin als N-terminale Peptidmodifikation übertragen, wodurch die Phagen an Streptavidin-Beads gebunden werden konnten. So konnte ein Protokoll etabliert werden, das in fünf Zyklen die Anreicherung des Hybridphagen aus einer 1:10.000 Mischung mit einem nicht spleißaktiven Kontrollphagen um den durchschnittlichen Faktor 290 gestattete. Schließlich wurde der Einfluss der Aminosäure an Position +2 des C-Exteins auf die Aktivität des an Position 104 gespaltenen DnaB-Inteins anhand von gereinigten Proteinen untersucht. Hierzu wurde mit einem degenerierten Oligonukleotid an jener Position eine sättigende Mutagenese durchgeführt. Neben der natürlich vorkommenden Aminosäure Ile zeigte von den untersuchten Aminosäuren vor allem Ala einen positiven Einfluss auf die Bildung des Spleißproduktes in einer in vitro Spleißreaktion, während z. B. Pro einen inhibierenden Effekt hatten