A novel fluorescence-based assay for the rapid detection and quantification of cellular deoxyribonucleoside triphosphates

Current methods for measuring deoxyribonucleoside triphosphates (dNTPs) employ reagent and labor-intensive assays utilizing radioisotopes in DNA polymerase-based assays and/or chromatography-based approaches. We have developed a rapid and sensitive 96-well fluorescence-based assay to quantify cellular dNTPs utilizing a standard real-time PCR thermocycler. This assay relies on the principle that incorporation of a limiting dNTP is required for primer-extension and Taq polymerase-mediated 5–3′ exonuclease hydrolysis of a dual-quenched fluorophore-labeled probe resulting in fluorescence. The concentration of limiting dNTP is directly proportional to the fluorescence generated. The assay demonstrated excellent linearity (R2 > 0.99) and can be modified to detect between ∼0.5 and 100 pmol of dNTP. The limits of detection (LOD) and quantification (LOQ) for all dNTPs were defined as <0.77 and <1.3 pmol, respectively. The intra-assay and inter-assay variation coefficients were determined to be <4.6% and <10%, respectively with an accuracy of 100 ± 15% for all dNTPs. The assay quantified intracellular dNTPs with similar results obtained from a validated LC–MS/MS approach and successfully measured quantitative differences in dNTP pools in human cancer cells treated with inhibitors of thymidylate metabolism. This assay has important application in research that investigates the influence of pathological conditions or pharmacological agents on dNTP biosynthesis and regulation

Triglyceride Blisters in Lipid Bilayers: Implications for Lipid Droplet Biogenesis and the Mobile Lipid Signal in Cancer Cell Membranes

Triglycerides have a limited solubility, around 3%, in phosphatidylcholine lipid bilayers. Using millisecond-scale course grained molecular dynamics simulations, we show that the model lipid bilayer can accommodate a higher concentration of triolein (TO) than earlier anticipated, by sequestering triolein molecules to the bilayer center in the form of a disordered, isotropic, mobile neutral lipid aggregate, at least 17 nm in diameter, which forms spontaneously, and remains stable on at least the microsecond time scale. The results give credence to the hotly debated existence of mobile neutral lipid aggregates of unknown function present in malignant cells, and to the early biogenesis of lipid droplets accommodated between the two leaflets of the endoplasmic reticulum membrane. The TO aggregates give the bilayer a blister-like appearance, and will hinder the formation of multi-lamellar phases in model, and possibly living membranes. The blisters will result in anomalous membrane probe partitioning, which should be accounted for in the interpretation of probe-related measurements

New Insights into the Evolution of Metazoan Tyrosinase Gene Family

Tyrosinases, widely distributed among animals, plants and fungi, are involved in the biosynthesis of melanin, a pigment that has been exploited, in the course of evolution, to serve different functions. We conducted a deep evolutionary analysis of tyrosinase family amongst metazoa, thanks to the availability of new sequenced genomes, assessing that tyrosinases (tyr) represent a distinctive feature of all the organisms included in our study and, interestingly, they show an independent expansion in most of the analyzed phyla. Tyrosinase-related proteins (tyrp), which derive from tyr but show distinct key residues in the catalytic domain, constitute an invention of chordate lineage. In addition we here reported a detailed study of the expression territories of the ascidian Ciona intestinalis tyr and tyrps. Furthermore, we put efforts in the identification of the regulatory sequences responsible for their expression in pigment cell lineage. Collectively, the results reported here enlarge our knowledge about the tyrosinase gene family as valuable resource for understanding the genetic components involved in pigment cells evolution and development

Traitement des papillomatoses laryngées par injections de cidofovir (étude pharmaceutique et approche clinique)

PARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

Etude des interactions lipides-calcium au sein des émulsions lipidiques nutritives par RMN et modélisation moléculaire

Ce travail traite de l'utilisation de la simulation de dynamique moléculaire et de la résonance magnétique nucléaire, deux approches complémentaires dans la caractérisation à l'échelle moléculaire des émulsions lipidiques pour nutrition parentérale. Des modèles de monocouche de phospholides à l'interface de l'eau et de l'huile ont été développés pour simuler les globules lipidiques des émulsions lipidiques de nutrition parentérale : un de composition simple et un second de composition plus élaborée contenant plusieurs types de phospholipides dans la monocouche et plusieurs types de triglycérides dans la phase huileuse. Les propriétés de chacun de ces modèles ont été étudiés (aire molaire, densité, potentiel, paramètre d'ordre des chaînes aliphatiques phospholipides, hydratation,...) et comparer à des modèles de bicouches phospholipidiques hydratées publiées et également simulées par nos soins, dans des conditions de simulation identiques. Dans un second temps, des simulations avec différentes quantités d'ions calcium ajoutées dans la phase aqueuse de notre modèle d'émulsion lipidique ont été mises en oeuvre pour étudier l'influence des ions calcium sur les propriétés des lipides. Les ions calciums interagissent avec les atomes des fonctions carbonyls des phospholipides avec un nombre de coordination de 7 atomes. L'aire molaire des monocouches est abaissée et l'ordre des chaînes aliphatiques est augmentant témoignant d'une augmentation de la rigidité des membranes. La seconde partie de ce travail porte sur l'emploi de la RMN. Les spectres 1H en 1D et 2D, 13C, 31P, 2D DOSY ont été obtenus pour l'émulsion lipidique commerciale. Un traitement par ultracentrifugation a permis de fractionner l'émulsion en plusieurs fractions pour faciliter l'analyse. Ces analyses ont révélées l'hétérogénéité de l'émulsion en terme de types et de tailles de particules : des gouttelettes lipidiques entourées par une monocouche phospholipidiques sont présentes ainsi que des petites vésicules de phospholipides organisées en bicouches. L'ajout des ions calcium a permis de caractériser l'intéraction lipides-calcium. L'ensemble des particules lipidiques interagisse avec les ions calcium mais ce sont les gouttelettes lipidiques qui sont responsables de la déstabilisation de l'émulsion lipidique par agrégation des particules.CHATENAY M.-PARIS 11-BU Pharma. (920192101) / SudocSudocFranceF