The sonic hedgehog signaling pathway is reactivated in human renal cell carcinoma and plays orchestral role in tumor growth

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Human clear cell renal cell carcinoma (CRCC) remains resistant to therapies. Recent advances in Hypoxia Inducible Factors (HIF) molecular network led to targeted therapies, but unfortunately with only limited clinical significance. Elucidating the molecular processes involved in kidney tumorigenesis and resistance is central to the development of improved therapies, not only for kidney cancer but for many, if not all, cancer types. The oncogenic PI3K/Akt, NF-kB and MAPK pathways are critical for tumorigenesis. The sonic hedgehog (SHH) signaling pathway is crucial to normal development.</p> <p>Results</p> <p>By quantitative RT-PCR and immunoblot, we report that the SHH signaling pathway is constitutively reactivated in tumors independently of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene expression which is inactivated in the majority of CRCC. The inhibition of the SHH signaling pathway by the specific inhibitor cyclopamine abolished CRCC cell growth as assessed by cell counting, BrdU incorporation studies, fluorescence-activated cell sorting and β-galactosidase staining. Importantly, inhibition of the SHH pathway induced tumor regression in nude mice through inhibition of cell proliferation and neo-vascularization, and induction of apoptosis but not senescence assessed by in vivo studies, immunoblot and immunohistochemistry. Gli1, cyclin D1, Pax2, Lim1, VEGF, and TGF-β were exclusively expressed in tumors and were shown to be regulated by SHH, as evidenced by immunoblot after SHH inhibition. Using specific inhibitors and immunoblot, the activation of the oncogenic PI3K/Akt, NF-kB and MAPK pathways was decreased by SHH inhibition.</p> <p>Conclusions</p> <p>These findings support targeting SHH for the treatment of CRCC and pave the way for innovative and additional investigations in a broad range of cancers.</p

Les Récepteurs de l'hormone parathyroïdienne dans le lit vasculaire rénal du rat

Il est à présent bien établi que la protéine apparentée à l'hormone parathyroïdienne (PTHrP), une poly-hormone synthétisée de façon quasi-ubiquitaire dans l'organisme, est non seulement capable de stimuler la résorption osseuse et la réabsorption rénale du calcium (comme la PTH) mais est également impliquée dans de nombreuses fonctions telles le développement, le transport de calcium et la relaxation des muscles lisses extravasculaires et vasculaires, in vivo et in vitro. Bien que structurellement peu semblables, la PTH et la PTHrP se lient et activent avec des affinités similaires un récepteur commun : le R-PTH1 couplé aux protéines G et aux voies signalétiques de l'adénylate cyclase et de la phospholipase C. Cependant, une implication de la voie transductrice du monoxyde d'azote (NO) dans la réponse vasodilatatrice à la PTHrP a été mise en évidence dans certains modèles expérimentaux. Le R-PTH1 est majoritairement exprimé dans l'os et le rein mais également dans d'autres tissus dont le système cardiovasculaire où il intervient dans la modulation de la pression artérielle. Un second membre de la famille des récepteurs de la PTH : le récepteur PTH2 a été identifié en 1995. Contrairement au R-PTH1 qui est abondamment exprimé dans un large éventail de tissus, le R-PTH2 est préférentiellement exprimé dans l'hypothalamus et le système cardiovasculaire (surtout le muscle lisse et l'endothélium vasculaires) mais son rôle physiologique n'a pas encore été déterminé avec certitude. La particularité du R-PTH2 est que la PTHrP ne s'y fixe pas, que la PTH semble n'être qu'un agoniste partiel de ce récepteur et que son ligand endogène est un peptide hypothalamique : le peptide tubéroinfundibulaire (TIP39). L'étude du système TIP39/R-PTH2 est encore à l'état embryonnaire mais son expression vasculaire suggérerait sa participation dans la modulation fine de l'hémodynamique rénale. Dans ce contexte, nous rapportons dans ce mémoire (1) la mise en évidence d'une expression des transcrits du TIP39 et du R-PTH2 dans les arbres artériels intrarénaux chez le rat et les cellules musculaires lisses vasculaires rénales ; (2) un rôle tonique complexe du TIP39 dans les lits vasculaires rénaux chez le rat ; (3) la mise en évidence d'une vasodilatation indépendante de l'activation du R-PTH1 par le TIP39 et les peptides dérivés de la PTH et de la PTHrP. Ces premières données plaident en faveur d'une participation du système TIP39/R-PTH2 dans l'homéostasie de l'hémodynamique rénale et d'une probable intervention du TIP39 dans la régulation du système cardiovasculaire. L'exploration de l'implication de la voie signalétique du NO dans la modulation de la réponse vasodilatatrice induite par la PTHrP a permis de mettre en évidence (1) une implication de la viscosité du milieu de perfusion et du NO et de ses radicaux sur le tonus basal rénal ; (2) une implication de la viscosité et du NO et de ses radicaux sur la cinétique de la dilatation en réponse à la PTHrP...Parathyroid hormone-related protein, or PTHrP, a poly-hormone ubiquitously expressed stimulates bone resorption and renal calcium reabsorption, as does PTH. PTHrP is also involved in development, trans-epithelial calcium transport and smooth muscle relaxation in vivo and in vitro. Both PTH and PTHrP bind with similar affinities to a common PTH/PTHrP receptor (named the PTH1-R) coupled to adenylate cyclase and phospholipase C pathways. More recently the nitric oxide (NO) transduction pathway has also been demonstrated to be stimulated by PTHrP, via the PTH1-R, and to account for some of the effects of PTHrP especially in the cardiovascular system. As PTHrP, the PTH1-R is expressed not only in bone and kidney but also in many other tissues including the cardiovascular system. From various studies performed in vitro and in vivo especially using transgenic mice overexpressing PTHrP or the PTH1-R in vascular smooth muscle (VSM), it is now well admitted that PTHrP functions as a regulator of blood pressure, heart rate and modulates peripheral vascular tones. A second member of the PTH receptor family was identified in 1995 : the PTH2-R. Unlike the PTH1-R which is ubiquitously distributed, the PTH2-R expression is restricted to the brain (mainly hypothalamus) and the cardiovascular system, in VSM and endothelial cells. The particularity of the PTH2-R is to be able to bind PTH but not PTHrP although PTH appears at present as a weak agonist of this receptor. More recently, an endogenous peptide was isolated from the hypothalamus and found to be a potent agonist on the PTH2-R. This peptide is the tuberoinfundibular peptide of 39 residues (TIP39). A limited structural homology was found with both PTH and PTHrP. A more profound investigation revealed that TIP39, PTH and PTHrP are indeed phylogenetically affiliated. Although the biological meaning of the PTH2-R has not been determined with certainty, it seems to be implicated at least in nociception and spermatogenesis. However, the presence of the PTH2-R in vascular tissues arguments favorably for a role for this receptor in regulating some vascular functions. As evoked above, PTHrP-induced vasodilation in various vascular beds including the kidney results from the stimulation, via the PTH1-R, of various intracellular pathways including NO release stimulation.[...].STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

ROLES TONIQUES ET TROPHIQUES DE LA PTHRP DANS LE SYSTEME RENOVASCULAIRE AU COURS DE L'HYPERTENSION GENETIQUE CHEZ LE RAT

STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Pertinence physiopathologique du système PTHrP dans la sphère urologique (tonus caverneux et carcinome du rein)

STRASBOURG-Medecine (674822101) / SudocSudocFranceF

Implication de la protéine apparentée à l'hormone parathyroïdienne (PTHrP) dans la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires et identification d'une cible nucléaire de la PTHrP

In vivo, les cellules musculaires lisses vasculaires sont continuellement soumises au stretch mécanique. Dans des conditions pathologiques, ce stretch mécanique est augmenté et participe au remodelage vasculaire. Notre laboratoire avait montré que la PTHrP exerce des effets paradoxaux sur la prolifération des CMLV, à savoir une inhibition auto/paracrine et une stimulation intracrine. Dans cette étude, des CMLV issus de vaisseaux de résistance (rein) et de conductance (aorte) ont été utilisées. Le rôle de la PTHrP sur la prolifération des CMLV stretchées a été appréhendé. Nous montrons que l'expression de PTHrP est augmentée en réponse au stretch mécanique et qu'elle s'oppose par un mécanisme intracrine à l'effet inhibiteur du stretch sur la prolifération. De plus, nous montrons que l'expression de la PTHrP est contrôlée de façon post transcriptionnelle par le stretch mécanique. Ces résultats suggèrent que la PTHrP pourrait jouer un important rôle dans la modulation de la prolifération des CMLV en réponse au stretch mécanique.L'élucidation des voies intracrines de la PTHrP est un enjeu de taille. Les précédents modèles n'ont pu être utilisés pour étudier les effets de la PTHrP endogène. Pour cela, des cultures de CMLV ont été obtenues à partir de souris transgéniques dont l'exon 4 de la PTHrP a été "floxé". Ces cellules ont été transféctées par la Cre recombinase pour exciser le gène de la PTHrP et étudier les effets de la PTHrP endogène ainsi que les effets de la PTHrP auto/paracrine et intracrine par la transfection de différentes constructions de PTHrP. Une des cibles nucléaires identifiées est la culline 3, impliquée dans la dégradation de la cycline E, Nrf2 et la Topoisomérase I. Son expression est stimulée dans les CMLV en réponse à la PTHrP comprenant la SLN et le stretch mécanique, ainsi que dans les carcinomes rénaux à cellules claires surexprimant la PTHrP, suggérant une possible implication de la PTHrP et la culline 3 dans la cancérogénèse.In vivo, vascular smooth muscle cells (VSMC) are continuously exposed to mechanical cyclic stretch due to the pulsatile blood flow from the cardiac contractile cycle. Stretch is altered in pathological conditions and contribute to vascular remodeling by modulating VSMC proliferation and death. We have previously shown that PTHrP inhibits VSMC proliferation through the auto/paracrine pathway but stimulates VSMC proliferation through the intracrine pathway by translocating into the nucleus. Here we used VSMC isolated from both resistance and compliance vessels to study the role of PTHrP in VSMC proliferation under experimental stretch. We show that PTHrP gene expression is up-regulated by stretch and that PTHrP opposes the inhibitory effect induced by stretch on VSMC proliferation through the intracrine pathway. In addition, we demonstrate that PTHrP expression is controlled at the post-transcriptional level by stretch. These results strongly suggest that PTHrP plays a critical role in the modulation of VSMC proliferation in response to stretch. Elucidation of intracrine pathway of PTHrP is a reel challenge, nothing is known for years. Previous models are unable to define effect of endogenous PTHrP. Here, I used primary VSMC derived from transgenic mice in which exon 4 of the PTHrP was floxed. These cells were transfected with a Cre recombiase to obtain PTHrP null cells. Then it was possible to study endogenous PTHrP and intracrine or paracrine effect of PTHrP with transfection of different mutant construction. One of the nuclear target identified was the cullin-3 which is implicated in degradation of the cycle E, Nrf2 and the topoisomerase I. Cullin 3 expression is upregulated in VSMC both in response of transfection with PTHrP and mechanical stretch but not with transfection with a mutant PTHrP without the nuclear localization signal and in clear cell renal carcinoma which strongly expressed PTHrP indicating a possible implication of PTHrP and cullin 3 in cancer.STRASBOURG-Sc. et Techniques (674822102) / SudocSudocFranceF

Parathyroid hormone-related protein detection and interaction with NO and cyclic AMP in the renovascular system

Parathyroid hormone-related protein detection and interaction with NO and cyclic AMP in the renovascular system. The presence of parathyroid hormone-related protein (PTHrP) in human kidney vasculature and the signal transduction pathways stimulated during PTHrP-induced vasodilation of the rabbit kidney were investigated. Immunostaining of human kidney revealed the abundant presence of PTHrP in media and intima of all microvessels as well as in macula densa. In isolated perfused rabbit kidney preconstricted with noradrenaline, 10-5 m Rp-cAMPS, a direct inhibitor of protein kinase A, produced comparable inhibition of 2.5 × 10-7 m forskolin- and 10-7 m PTHrP-induced vasorelaxations. Renal vasorelaxation and renal microvessel adenylyl cyclase stimulation underwent comparable desensitization following exposure to PTHrP. Nitric oxide (NO)-synthase inhibition by L-NAME (10-4 m), NO scavenging by an imidazolineoxyl N-oxide (10-4 m) and guanylyl cyclase inhibition by methylene blue (10-4 m) decreased PTHrP-induced vasorelaxation by 27 to 53%, abolished bradykinin-induced vasorelaxation and did not affect forskolin-induced vasorelaxation. The effects of Rp-cAMPS and L-NAME were not additive on PTHrP-induced vasorelaxation. Damaging endothelium by treating the kidney with either anti-factor VIII-related antibody and complement, gossypol or detergent, did not affect PTHrP- or forskolin-induced vasorelaxations but reduced bradykinin-induced vasorelaxation by 53 to 92%. Conversely, endothelial damage did not alter the inhibitory action of L-NAME on PTHrP-induced vasorelaxation. In conclusion, PTHrP is present throughout the human renovascular tree and juxtaglomerular apparatus. Activation of both adenylyl cyclase/protein kinase A and NO-synthase/guanylyl cyclase pathways are directly linked to the renodilatory action of PTHrP in a way that does not require an intact endothelium in the isolated rabbit kidney