The genetic interaction network of CCW12, a Saccharomyces cerevisiae gene required for cell wall integrity during budding and formation of mating projections

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Mannoproteins construct the outer cover of the fungal cell wall. The covalently linked cell wall protein Ccw12p is an abundant mannoprotein. It is considered as crucial structural cell wall component since in baker's yeast the lack of <it>CCW12 </it>results in severe cell wall damage and reduced mating efficiency.</p> <p>Results</p> <p>In order to explore the function of <it>CCW12</it>, we performed a Synthetic Genetic Analysis (SGA) and identified genes that are essential in the absence of <it>CCW12</it>. The resulting interaction network identified 21 genes involved in cell wall integrity, chitin synthesis, cell polarity, vesicular transport and endocytosis. Among those are <it>PFD1</it>, <it>WHI3</it>, <it>SRN2</it>, <it>PAC10</it>, <it>FEN1 </it>and <it>YDR417C</it>, which have not been related to cell wall integrity before. We correlated our results with genetic interaction networks of genes involved in glucan and chitin synthesis. A core of genes essential to maintain cell integrity in response to cell wall stress was identified. In addition, we performed a large-scale transcriptional analysis and compared the transcriptional changes observed in mutant <it>ccw12</it>Δ with transcriptomes from studies investigating responses to constitutive or acute cell wall damage. We identified a set of genes that are highly induced in the majority of the mutants/conditions and are directly related to the cell wall integrity pathway and cell wall compensatory responses. Among those are <it>BCK1</it>, <it>CHS3</it>, <it>EDE1</it>, <it>PFD1</it>, <it>SLT2 </it>and <it>SLA1 </it>that were also identified in the SGA. In contrast, a specific feature of mutant <it>ccw12</it>Δ is the transcriptional repression of genes involved in mating. Physiological experiments substantiate this finding. Further, we demonstrate that Ccw12p is present at the cell periphery and highly concentrated at the presumptive budding site, around the bud, at the septum and at the tip of the mating projection.</p> <p>Conclusions</p> <p>The combination of high throughput screenings, phenotypic analyses and localization studies provides new insight into the function of Ccw12p. A compensatory response, culminating in cell wall remodelling and transport/recycling pathways is required to buffer the loss of <it>CCW12</it>. Moreover, the enrichment of Ccw12p in bud, septum and mating projection is consistent with a role of Ccw12p in preserving cell wall integrity at sites of active growth.</p> <p>The microarray data produced in this analysis have been submitted to NCBI GEO database and GSE22649 record was assigned.</p

Der Einfluss von getrockneten Heidelbeeren und deren Anthocyanen auf die Colitis

Die Therapiemöglichkeiten für Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED) sind auch heute noch recht unbefriedigend. Daher war das Hauptziel dieser Dissertation neue Therapieoptionen zu untersuchen. Für getrocknete Heidelbeeren (gHB) und deren Anthocyane (AC) konnten bereits protektive Eigenschaften nachgewiesen werden, die bei der Behandlung einer Colitis nützlich sein könnten. Neben diesen Substanzen wurde auch die Hemmung der gewebeschädigenden Cathepsine (CTS) B, D und L untersucht. Weiterhin wurde die Expression der in den NF-κB-Signalweg eingreifenden Proteine TANK und TBK1 in intestinalen Makrophagen (IMAC) im Vergleich zu ihrer Vorstufe den Monozyten untersucht, sowie die daraus resultierende Reaktivität der Zellen. 1.1. Einfluss von gHB und AC bei der experimentellen Colitis Der Einfluss der gHB bzw. der AC wurde im murinen Modell der akuten bzw. chronischen DSS-Colitis untersucht. Dazu wurden die Substanzen unter das Futter gemischt. Es zeigte sich, dass gHB bei der akuten Colitis verschiedene Colitisparameter positiv beeinflussten, bei der chronischen Colitis jedoch nur die Kolonlänge. Die 1% und 10% AC-Konzentrationen im Futter führten zu einer deutlichen Besserung der untersuchten Parameter sowohl bei der akuten als auch der chronischen Colitis. Anhand eines TUNEL-Assay konnte gezeigt werden, dass gHB und AC die Apoptose in Epithelzellen reduzieren. Aufgrund der Daten sind gHB wahrscheinlich für die Behandlung einer akuten Schädigung geeignet, während sie für die Therapie von CED eher nicht in Frage kommen. AC hingegen scheinen sowohl für die Behandlung von akuten Schädigungen als auch von CED neue Therapiemöglichkeiten darzustellen. 1.2. Einfluss von AC auf die Makrophagenzelllinie MM6 Anhand der humanen Makrophagenzelllinie MM6 sollte ein möglicher Signalweg gefunden werden, der durch AC reguliert wird und deren anti-entzündliche Wirkung erklärt. Dazu wurden verschiedene Stimulationsansätze durchgeführt und die Zellen gleichzeitig mit verschiedenen AC-Konzentrationen inkubiert. Die Auswertung der IL-8 Sekretion zeigte keinen bestimmten Signalweg, jedoch kam es dosisabhängig zur AC-Konzentration zu einer Reduktion der IL-8 Sekretion. Apoptosemessungen und ein Stoffwechselaktivitätstest haben gezeigt, dass AC nur in höheren Dosierungen Apoptose induzieren. Der Rückgang von IL-8 bei geringeren Dosierungen ist jedoch auf die anti-entzündlichen Eigenschaften der AC zurückzuführen. 1.3. Hemmung der CTS-Proteasen Zunächst wurden die Auswirkungen der Hemmung von CTS B bzw. L im Modell der akuten DSS-Colitis untersucht. Die Hemmung wurde durch Injektion eines spezifischen Inhibitors sichergestellt. Es stellte sich heraus, dass die Inhibition von CTSB bei allen untersuchten Parametern etwas effektiver war als die von CTSL. Außerdem kam es durch den CTSL-Inhibitor zu einem Anstieg pro-inflammatorischer Zytokine auch in gesunden Mäusen, so dass CTSL als möglicher Therapieansatz ausgeschlossen wurde. Des Weiteren wurde die Hemmung von CTSB und CTSD (Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe haben bereits eine mögliche Bedeutung von CTSD bei CED nachgewiesen) in der chronischen DSS-Colitis getestet, um einen Bezug zu CED zu schaffen. Dafür wurden Knock-out Mäuse von CTSB bzw. CTSD gezüchtet. Es stellte sich heraus, dass der Knock-out von CTSD eine leichte Besserung der Colitis-Symptome im Vergleich zum Wildtyp bewirkte, während das Ausschalten des CTSB-Gens einen negativen Effekt zur Folge hatte. Anhand der Vordaten zu CTSD und der in dieser Arbeit gezeigten Besserung der chronischen Colitis in Knock-out Tieren stellt die Inhibition von CTSD einen weiteren Therapieansatz für CED-Patienten dar. Die Hemmung von CTSB bewirkte in der akuten Colitis eine Besserung, jedoch zeigte die Hemmung von CTSB in den Knock-out Tieren während der chronischen DSS-Colitis keine Besserung der Colitis-Symptome. 1.4. Regulation des pro-entzündlichen Faktors NF-κB in IMAC und Monozyten TANK und TBK1 spielen bei der Regulation von NF-kB eine Rolle. Mittels Real-time-PCR wurde die Expression in Monozyten und IMAC von Kontroll- und CED-Patienten untersucht. Es zeigte sich, dass TBK1 nicht reguliert wird. TANK hingegen wird in IMAC stärker und in Monozyten weniger exprimiert. Aufgrund dessen ging man davon aus, dass Makrophagen reaktionsträger sind als Monozyten. Tatsächlich konnte diese Annahme durch Stimulation der IMAC und Monozyten mit TNF und anschließender Messung der IL-6 Sekretion bestätigt werden. Die Stimulation mit TNF bewirkte sowohl in IMAC als auch Monozyten eine erhöhte Expression von TANK und TBK1, wobei der Anstieg von TBK1 höher war. Anhand der Expressionsanalysen müssten alle Zellen gleich auf TNF reagieren. Dies widerspricht jedoch den IL-6 Konzentrationsmessungen, weshalb ein posttranskriptioneller Regulationsmechanismus in den IMAC vermutet wird