Characterization of Cephalosporinases Produced by Clinical Isolates of Enterobacteriacae in North Lebanon

Background: The problem of Enterobacteriacae resistance to β-Lactamase drugsis of growing concern in hospitals. Enterobacteria have developed multiple mechanismsof resistance to antibiotics, the main one is the enzymatic resistance mediatedby the beta-lactamases. This study aims to characterize the occurrence ofcephalosporinases in clinical isolates of Enterobacteriacae isolates in North Lebanon.Methods. Twenty two strains of Enterobacteriacae producing high level of cephalosporinaseshave been studied. The antibiotic susceptibility of each strain wastested on Mueller Hinton agar contains cloxacilline (250 mg/L) and by using E-testaccording the guidelines of the Antibiogram Committee of the French Society forMicrobiology. The search for plasmid-mediated cephalosporinases was performedusing PCR and primers for plasmid-mediated cephalosporinases genes (CMY-2,DHA-1, ACT-1, ACC-1, FOX-1 and MOX-1).Results: Thirteen positive strains were detected, of these 9 strains produced theplasmid-mediated cephalosporinase (CMY-2) and one strain produced the plasmidmediatedcephalosporinase (DHA-1). The remaining 9 strains were high-level chromosomalcephalosporinase producers since they belong to group-three Enterobacteria.They did neither produce plasmid-mediated cephalosporinase, nor did theyhave resistance to third generation cephalosporins except for cefepim. Two strains(CMUL E. coli 021) and CMUL E. coli 255) which were not susceptible for cefepim byE-test produced plasmid-mediated cephalosporinase The sequencing result of these2 E.coli strains did not show any mutation in the promoter that is responsible forhigh expression level of the chromosomal cephalosporinase. All examined strainsproducing plasmid-mediated cephalosporinase CMY-2 were analyzed by ERIC-PCRtechnique. The results showed that two of these strains had the same pattern (C4and C5) and three others had another pattern (C10, C12 and C13).Conclusion: This study shows the variations of cephalosporinases produced byclinical isolates of Enterobacteriacae in North Lebanon

Emergence de la résistance à l'ertapénème chez une souche clinique de Escherichia coli productrice d'une céphalosporinase à spectre étendu

L usage des céphalosporines à large spectre puis des carbapénèmes dans le traitement des infections à Escherichia coli a favorisé l émergence de souches résistantes. Jusqu à présent la résistance aux carbapénèmes était toujours imputable à la production de b-lactamases plasmidiques à large spectre, comme OXA-48, KPC et les métallo-b-lactamases. Nous démontrons dans cette étude que les céphalosporinases chromosomiques peuvent aussi contribuer à la résistance aux carbapénèmes chez E. coli. Les mécanismes de résistance de la souche clinique E. coli MEV isolée à partir d hémocultures et présentant une résistance à toutes les pénicillines, à toutes les céphalosporines et à l ertapénème, ont été caractérisés d un point de vue moléculaire phénotypique, et biochimique. L analyse moléculaire a révélé que la souche MEV hyperproduit sa céphalosporinase chromosomique suite à des mutations dans la séquence promotrice du gène. D autre part, l enzyme présente une modification structurale due à une duplication du résidu sérine en position 282 qui est responsable d un élargissement du spectre d hydrolyse. En effet, la caractérisation biochimique de la céphalosporinase AmpC MEV révèle une augmentation de son efficacité catalytique (kcat/Km) vers les céphalosporines et les carbapénèmes, qui est due à une augmentation de son affinité pour ces substrats. L expression phénotypique de l activité carbapénémase de cette nouvelle céphalosporinase à spectre étendu nécessite cependant l association à un mécanisme de résistance additionnel. L absence de restauration de la sensibilité à l ertapénème par le PAbN, qui est un inhibiteur du système d efflux AcrAB-TolC, exclut la contribution de ce mécanisme. Par contre, l analyse des protéines membranaire par SDS-PAGE a mis en évidence une perte d expression des deux porines majeures OmpC et OmpF responsable d une imperméabilité. Cette étude montre que les céphalosporinases à spectre étendu constituent un mécanisme de résistance émergent qui menace la sensibilité aux carbapénèmes chez les entérobactéries.The use and overuse of extended-spectrum b-lactams in the treatment of Escherichia coli infections has selected carbapenem-resistant isolates. To date, carbapenem resistance in this species has always been related to transmissible b-lactamases, such as OXA-48, KPC and metallo-enzymes. This study demonstrates for the first time that chromosome-borne cephalosporinases may also contribute to carbapenem resistance. The E. coli isolate MEV that was responsible for bloodstream infection was resistant to penicillins, cephalosporins and ertapenem. Phenotypical, molecular and biochemical characterization were performed to identify the mechanisms of resistance. Molecular analysis revealed that E. coli MEV overexpressed its chromosome-borne cephalosporinase (AmpC b-lactamase) due to mutations in the promoter region. Moreover, the analysis of the coding sequence showed a duplication of the serine residue at position 282, according to the sequence of the wild-type cephalosporinase, that accounted for broadened hydrolysis spectrum. Indeed, the biochemical characterization of AmpC-MEV b-lactamase revealed increased catalytic efficiencies (kcat/Km) toward cephalosporins and carbapenems, due to enhanced affinity for these substrates. Cloning experiments of the ampC gene showed that AmpC MEV b-lactamase did not confer per se ertapenem resistance, which suggested the association of an additional mechanism of resistance. Phenylalanine-Arginine b-Naphthylamide (PAbN), which is an inhibitor of RND efflux systems, failed to restore the ertapenem susceptibility of E. coli MEV. In the opposite, the analysis of the outer membrane proteins (OMP) of the clinical isolate by SDS-PAGE showed weak expression of OmpC and OmpF proteins, in agreement with a the lack of permeability. This study shows that extended-spectrum cephalosporinases constitute an emerging mechanism of resistance threatening carbapenem susceptibility in Enterobacteriaceae.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Caractérisation de l'activité carbapénémase de la b-lactamase à spectre étendu (BLSE) CTX-M-15

Introduction : La résistance aux carbapénèmes chez les entérobactéries est fréquemment décrite chez des souches productrices de b-lactamases à spectre étendu (BLSE) qui ont perdu leur perméabilité membranaire. L'objectif de notre étude fut de caractériser la résistance à l'ertapénème chez une souche de Klebsiella pneumoniae isolée au CHU de Lille. Matériel et méthodes : Les gènes des b-lactamases ont été identifiés par clonage aléatoire et par PCR. Les amplicons ont été clonés dans la souche imperméable Escherichia coli HB4 pour révéler l'activité carbapénémase. Le rôle dans la résistance aux carbapénèmes de la substitution D240G, qui est responsable de l'élargissement du spectre de CTX-M-15 vers la ceftazidime, a été déterminé par mutagénèse dirigée. Résultats : La souche produisait les b-lactamases CTX-M-15, TEM-1, SHV-11 et OXA-1. Une fois clonée dans E. coli HB4, seule l'enzyme CTX-M-15 conférait une résistance à l'ertapénème, sans affecter la sensibilité de l'imipénème et de la tazocilline. CTX-M-15 et son progéniteur CTX-M-3, obtenu par mutagénèse dirigée, conféraient des niveaux de résistance similaires à l ertapénème, démontrant que la substitution D240G n était pas impliquée dans l activité carbapénémase. Conclusions : Cette étude caractérise pour la première fois le spectre d'hydrolyse de CTX-M-15 vis-à-vis des carbapénèmes. L'approche moléculaire a montré que la substitution D240G n'était pas à l'origine de l'activité carbapénémase suggérant que toutes les CTX-M peuvent promouvoir la sélection de mutants résistants à l'ertapénème. La tazocilline pourrait constituer une bonne alternative thérapeutique dans le traitement des infections à E. coli CTX-M(+).AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Activité carbapénémase des b-lactamases de type AmpC

Les b-lactamases de type AmpC (céphalosporinases) semblent fréquemment responsables de la résistance aux carbapénèmes chez les entérobactéries, ce que permettent d évoquer de nombreuses descriptions cliniques. L objectif de cette thèse était d effectuer une caractérisation phénotypique, biochimique et moléculaire de l activité carbapénémase des AmpC. Tout d abord, les gènes des cinq principales céphalosporinases plasmidiques ont été clonés puis transformés dans la souche imperméable Escherichia coli HB4. Les comparaisons phénotypiques et structurales des clones recombinants ont montré que les céphalosporinases CMY-2, ACT-1, et DHA-1 se distinguent des autres enzymes par leur capacité à conférer une résistance aux carbapénèmes et par la présence d une asparagine en position 346 (Asn 346), située à proximité du site catalytique. Des expériences de mutagénèse dirigée, consistant à substituer l'Asn 346 par des résidus de taille, de charge et de polarité différentes dans la céphalosporinase CMY-2, ont démontré le rôle de cet acide aminé dans l activité carbapénémase des céphalosporinases. La caractérisation biochimique de trois variants a révélé que l'Asn 346 contribue à l affinité de CMY-2 pour l'imipénème. L'étude de l activité carbapénémase des AmpC chromosomiques à spectre étendu (ACSE) a constitué le second volet de la thèse. Le séquençage, le clonage et la caractérisation biochimique d'une nouvelle ACSE produite par une souche clinique de E. coli résistante à l'ertapénème ont démontré que l'extension du spectre d'hydrolyse des céphalosporinases, qui est due à une augmentation de leur affinité, peut être aussi responsable d'une résistance aux carbapénèmes.Owing to several clinical reports, it appears that AmpC-type b-lactamases (cephalosporinases) account frequently for carbapenem resistance in Enterobacteriaceae. The aim of this study was to perform a phenotypic, biochemical, and molecular characterization of the carbapenem-hydrolyzing activity of AmpC-type b-lactamases. First of all, the genes encoding the five main plasmid-mediated AmpC b-lactamases were cloned and transferred into the porin-deficient Escherichia coli HB4 strain. Phenotypic and molecular comparison of the recombinant strains revealed that only CMY-2, ACT-1, and DHA-1 conferred resistance to carbapenems and had an asparagine residue at position 346 (Asn 346), located in the vicinity of the active site. Site-directed mutagenesis experiments were performed to replace the Asn 346 residue of CMY-2 b-lactamase by amino acids differing in size, charge, and polarity. It confirmed the contribution of Asn 346 to the carbapenem-hydrolysing activity of cephalosporinases. Biochemical characterization of three variants revealed that Asn 346 assisted the binding of imipenem.The analysis of the carbapenem-hydrolyzing activity of chromosomal extended-spectrum AmpC b-lactamases (ESAC) constitutes the second part of this thesis. Sequencing, cloning and biochemical characterization of a novel ESAC produced by an ertapenem-resistant E. coli clinical isolate demonstrated that the extension of the hydrolysis spectrum of cephalosporinases, which was due to increased affinity, may also contribute to carbapenem resistance.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Mise au point d'un test phénotypique basé sur la restauration de la sensibilité au moxalactam par l'EDTA pour l'identification rapide des métallo-b-lactamases chez les entérobactéries

Face à l émergence des b-lactamases à spectre étendu et des céphalosporinases hyperproduites et plasmidiques, l utilisation des carbapénémes s est accentuée favorisant la sélection de souches productrices de carbapénémases. Les métallo-b-lactamases (MBL) telles que NDM-1 sont un enjeu de santé publique en raison de leur caractère transmissible fortement épidémique parmi les entérobactéries. Les recommandations actuelles conseillent de tester la sensibilité aux carbapénèmes pour le screening des souches d entérobactéries sécrétrices de MBL et la mise en œuvre de techniques complémentaires, comme le Hodge test, pour confirmer le résultat. Malheureusement, cette méthode est prise à défaut lorsque le niveau de production de l enzyme est insuffisant pour conférer une résistance aux carbapénèmes. Pour se départir du problème, nous avons développé une nouvelle technique de dépistage basée sur la détermination de la sensibilité au moxalactam. Cette céphamycine présente la particularité d être exclusivement et fortement hydrolysée par les MBL. Nous avons testé le screening des MBL par le moxalactam (MOX) puis par un test de synergie MOX/EDTA utilisant un inhibiteur spécifique des MBL. Tous les transconjuguants et les souches cliniques produisant une MBL apparaissaient résistants au moxalactam. Le test de synergie MOX/EDTA s est révélé positif pour tous les isolats. Ce test de dépistage présente une sensibilité et une spécificité de 100 % pour le dépistage des MBL. Il s agit d une méthode de détection phénotypique peu coûteuse, rapide et facile d interprétation pouvant être utilisée en routine dans tous les laboratoires y compris ceux des pays émergents.The use of carbapenem has increased over the emergence of extended spectrum b-lactamases, thus allowing the selection of carbapenemase-producing clinical isolates. Metallo-b-lactamases (MBL) such as NDM-1 are a major public health problem due to their hight epidemic potential among Enterobacteriaceae. Current recommendations advocate suceptibility testing to carbapenems to screen for MBL producing enterobacterial and to carry out additionnal tests, such as the Hodge test, to confirm the result. Unfortunately, this approach fails to detect carbapenemase production in low-producing enterobacterial isolates. To overcome this lack of sensitivity, we developed a new screening technique based on susceptibility testing to moxalactam. This cephamycin has the pediculiarity to be highly hydrolysed by MBL but classes A, C, D b-lactamases. All MBL producing transconjugants and clinical isolates that were test in our study were resistant to moxalactam, thus confirming the sensitivity of this test. The MOX/EDTA synergy test was positive for all MBL isolates whereas it was negative for all clinical isolates producing KPC, AmpC or OXA-48 b-lactamases which confirms the specificity of this confirmation method. This assay, which is performed with inexpensive reagents, is appropriate for specific MBL identification in countries with limited resources.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Chromosome-Encoded β-Lactamases TUS-1 and MUS-1 from Myroides odoratus and Myroides odoratimimus (Formerly Flavobacterium odoratum), New Members of the Lineage of Molecular Subclass B1 Metalloenzymes

Myroides odoratus and Myroides odoratimimus (formerly designated in a single species as Flavobacterium odoratum) are gram-negative aerobes and sources of nosocomial infections in humans. They have variable susceptibility to β-lactams and a decreased susceptibility to carbapenems. Using genomic DNAs of M. odoratus CIP 103105 and M. odoratimimus CIP 103073 reference strains, shotgun cloning of β-lactamase genes was performed, followed by protein expression in Escherichia coli. The deduced amino acid sequences of these β-lactamase genes revealed that TUS-1 and MUS-1 from M. odoratus CIP 103105 and M. odoratimimus CIP 103073, respectively, shared 73% amino acid identity. Mature proteins TUS-1 and MUS-1, with pI values of 7.8 and 5.2, respectively, had relative molecular masses of ca. 26 kDa. These β-lactamases are members of the subclass B1 of metallo-β-lactamases and are distantly related to other metalloenzymes, being most closely related to IND-1 from Chryseobacterium indologenes (42% amino acid identity). However, phylogenic analysis showed that TUS-1 and MUS-1 belong to the same phylogenic lineage of subclass B1 enzymes that groups the subclass B1 β-lactamases of Flavobacterium species. Kinetic parameters of purified β-lactamases TUS-1 and MUS-1 detailed their hydrolysis spectra, which encompass most β-lactams except aztreonam. β-Lactamases TUS-1 and MUS-1 were classified in functional subgroup 3a of metalloenzymes. This work further characterizes chromosome-encoded metalloenzymes from Flavobacteriaceae species that explain at least part of their intrinsic resistance to β-lactams

In Vivo Selection of a Chromosomally Encoded β-Lactamase Variant Conferring Ceftazidime Resistance in Klebsiella oxytoca

Klebsiella oxytoca clinical isolate A was recovered from the urine of a 55-year-old man with prostatic and urinary tract infections. This isolate displayed a β-lactam resistance phenotype consistent with overproduction of a chromosomally encoded class A β-lactamase and had decreased susceptibilities to all β-lactams except ceftazidime, cephamycins, and carbapenems. Four weeks after treatment with an antibiotic regimen that included ceftazidime, K. oxytoca isolate B, which had a high level of resistance to ceftazidime, was isolated from the urine of the same patient. Isoelectric focusing analysis of the culture extracts of these isolates gave a pI of 5.4 for both isolates. Cloning experiments with the PCR products of the bla(OXY) gene resulted in two Escherichia coli DH10B recombinant clones with resistance phenotypes mirroring those of the parental isolates. Sequencing analysis revealed that the bla(OXY-2-5) gene from K. oxytoca B had a single nucleotide substitution compared to the sequence of the bla(OXY-2) gene from K. oxytoca A, leading to a proline-to-serine substitution at position 167, according to the numbering of Ambler. Biochemical analysis of purified OXY-2-5 showed that it had the ability to hydrolyze ceftazidime. This is the first report of in vivo selection of a K. oxytoca isolate that produced a chromosomally encoded β-lactamase conferring resistance to ceftazidime

TEM-121, a Novel Complex Mutant of TEM-Type β-Lactamase from Enterobacter aerogenes

Enterobacter aerogenes clinical isolate LOR was resistant to penicillins and ceftazidime but susceptible to cefuroxime, cephalothin, cefoxitin, cefotaxime, ceftriaxone, and cefepime. PCR and cloning experiments from this strain identified a novel TEM-type β-lactamase (TEM-121) differing by five amino acid substitutions from β-lactamase TEM-2 (Glu104Lys, Arg164Ser, Ala237Thr, Glu240Lys, and Arg244Ser) and by only one amino acid change from the extended-spectrum β-lactamase (ESBL) TEM-24 (Arg244Ser), with the last substitution also being identified in the inhibitor-resistant β-lactamase IRT-2. Kinetic parameters indicated that TEM-121 hydrolyzed ceftazidime and aztreonam (like TEM-24) and was inhibited weakly by clavulanic acid and strongly by tazobactam. Thus, TEM-121 is a novel complex mutant TEM β-lactamase (CMT-4) combining the kinetic properties of an ESBL and an inhibitor-resistant TEM enzyme

Emergence of Ertapenem Resistance in an Escherichia coli Clinical Isolate Producing Extended-Spectrum β-Lactamase AmpC▿

Escherichia coli isolate MEV, responsible for a bloodstream infection, was resistant to penicillins, cephalosporins, and ertapenem. Molecular and biochemical characterization revealed the production of a novel, chromosome-borne, extended-spectrum AmpC (ESAC) β-lactamase with a Ser-282 duplication and increased carbapenemase activity. This study demonstrates for the first time that chromosome-borne ESAC β-lactamases can contribute to the emergence of ertapenem resistance in E. coli clinical isolates