Radiofármaco teragnóstico basado en dendrímeros conjugados a ácido fólico y Lys3 -bombesina con nanopartículas de oro en la cavidad dendrítica

Theragnostics (or theranostics) is an acronym of therapeutics and diagnostics. In this project, theterm refers to molecular/macromolecular vectors of specific recognition and nanoplatforms thatincorporate both functions, diagnosisand therapy simultaneously. In addition, the incorporation ofdiagnostic and therapeutics functions may be useful in monitoring disease progress and evaluatingthe response to combined therapy.By using radiopharmaceuticals, it is possible to record and detect by in vivo imaging thespatio-temporal distribution of molecular or cellular processes for diagnostic and therapeuticapplications using nuclear medicine techniques. Lutetium-177-based radiopharmaceuticals areconsidered theranostic systems because of their gamma emission (208 keV ) useful for performingthe diagnostic image and its negative beta radiation(Emax0.498 M eV ) suitable for therapeuticapplications. In this thesis it is reported for the first time, the preparation of a new multivalent andmultifunctional lutetium-177 radiopharmaceutical based on a dendrimer (PAMAM-G4) containinggold nanoparticles, folic acid, and the peptide bombes insuitable for targeted radiotherapy,plasmonic-photothermal therapy and dual molecular imaging (optic and nuclear) of breast cancer.Therefore, the first aim of this research was to synthesize177Lu-dendrimer-folate-bombesin with gold nanoparticles (AuNPs) in the dendritic cavity (177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesin)and to evaluate the radiopharmaceutical potential for targeted radiotherapy and thesimultaneous detection of folate receptors (FRs) and gastrin-releasing peptide receptors (GRPRs)over-expressed in breast cancer cells. p-SCN-Benzyl-DOTA was linked to the dendrimer in anaqueous-basic medium. The carboxylate groups of Lys1Lys3(DOTA)-Bombesin and folic acid wereactivated with HATU and conjugated to the dendrimer.The conjugate was mixed with 1 % HAuCl4followed by the addition of NaBH4and purified byultrafiltration. Elemental analysis (EDS), particle size distribution (DLS), TEM analysis, UV-Vis,infrared and fluorescence spectroscopies were performed. The conjugate was radiolabeled using177LuCl3and analyzed by radio-HPLC. Studies confirmed the dendrimer functionalization withhigh radiochemical purity (> 95 %). Fluorescence results demonstrated that the presence of AuNPsin the dendritic cavity confers useful photophysical properties to the radiopharmaceutical for opticalimaging. Binding studies in T47D breast cancer cells showed a specific cell uptake (41.15 ± 2.72 %).177Lu-Dendrimer(AuNP)-Folate-Bombesin showed suitable properties as an optical and nuclearimaging agent for breast tumors over-expressing GRPR and FRs, as well as for target-specifictherapy. The integration of fluorescence and plasmonic properties into one molecule is of importancein developing multifunctional imaging and therapy nanoprobes.The second aim of this research was to evaluate the fluorescent properties and the plasmonic-photothermal therapeutic and radiotherapeutic potential of177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesinwhen it is internalized in T47D breast cancer cells. The intense NIR fluorescence emitted fromthe conjugate inside cells corroborated the usefulness of DenAuNP-Folate-Bombesin for opticalimaging. After laser irradiation, the presence of the nanosystem in cells caused a significant increasein the temperature of the medium resulting in a significant decrease in cell viability (down to 16.51± 1.52 %)due to the177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesin plasmonic properties. After treatment with177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesin, the T47D cell viability decreased 90 % because of the radiation absorbed dose (63.16 ± 4.20 Gy) delivered inside cells. In conclusion, the177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesin nanosystem internalized in cancer cells exhibited properties suitable for optical imaging,plasmonic-photothermal therapy, and targeted radiotherapy.Teragnósticos (o teranósticos) es un acrónimo de terapéuticos y diagnósticos. En este proyecto, el término se refiere a vectores moleculares/macromoleculares de reconocimiento específico y a nanoplataformas que incorporan ambas funciones, diagnóstico y terapia de forma simultánea. Además de incorporar funciones diagnósticas y terapéuticas, estas entidades pueden ser útiles en el seguimiento de la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la respuesta a la terapia combinada. Por otro lado, a través del uso de radiofármacos es posible registrar y detectar por imagen in vivo, la distribución espacio-temporal de procesos moleculares o celulares para aplicaciones diagnósticas y/o terapéuticas utilizando técnicas de medicina nuclear molecular. En particular, los radiofármacos basados en lutecio-177 son considerados teranósticos por su emisión gamma (208 keV ), útil para realizar la imagen diagnóstica, y por su emisión beta negativa (Emax 498 keV ) adecuada para aplicaciones terapéuticas. En este trabajo de tesis se reporta por primera vez, la preparación de un nuevo radiofármaco de lutecio-177 multivalente y multifuncional basado en un dendrímero (PAMAM-G4) conteniendo nanopartículas de oro en sus cavidades y conjugado a ácido fólico y al péptido bombesina, para su posible uso en radioterapia dirigida, terapia fototérmica plasmónica e imagen molecular dual (óptica y nuclear) de cáncer de mama. Por tanto, el primer objetivo de esta investigación fue sintetizar 177Lu-dendrímero-folato-bombesina con nanopartículas de oro (AuNPs) en la cavidad dendítica (177Lu-DenAuNPFolato-Bombesina) y evaluar el potencial del radiofármaco para la radioterapia dirigida y la detección simultánea de receptores de folato (FR) y de receptores del péptido liberador de gastrina (GRPRs) sobre-expresados en células de cáncer de mama. El p-SCN-bencil-DOTA se conjugó en medio acuoso básico a los grupos amino del dendrímero. Los grupos carboxilato de la Lys1-Lys3 (DOTA)-bombesina y el ácido fólico se activaron con HATU y también se conjugaron al dendrímero. El conjugado se mezcló con HAuCl4 seguido de la adición de NaBH4 y se purific´ mediante ultrafiltraci´on. Se realiz´o el an´alisis elemental (EDS), la distribuci´on de tamañó de partícula (DLS), análisis de TEM, espectroscopia de UV-Vis, infrarrojo y de fluorescencia. El conjugado se marcó radiactivamente usando 177LuCl3 y se analizó por radio-HPLC. Los estudios confirmaron la funcionalización del dendrímero con alta pureza radioquímica (> 95 %). Los resultados de fluorescencia demostraron que la presencia de AuNPs en las cavidades dendríticas confiere al radiofármaco propiedades físicas útiles para la obtención de imágenes ópticas. Los estudios de unión en células de cáncer de mama T47D mostraron una captación celular específica (41,15 ± 2,72 %). Por tanto, el 177Lu-DenAuNP-Folato-Bombesina presenta propiedades adecuadas como un agente de imagen óptica y nuclear para tumores de mama que sobre-expresan GRPR y FRs, así como un nanosistema con potencial para ser utilizado en radioterapia de blancos moleculares específicos. La integración de propiedades fluorescentes y plasmónicas en una molécula es de importancia en el desarrollo de nanosensores multifuncionales para imagen y terapia. El segundo objetivo de esta investigación fue evaluar las propiedades fluorescentes y el potencial terapéutico fototérmico plasmónico y radioterapéutico del 177Lu-DenAuNP-Folato-Bombesina cuando se internaliza en células T47D de cáncer de mama. La fluorescencia intensa NIR emitida a 825 nm del conjugado dentro de las células, corroboró la utilidad de DenAuNP-Folato-Bombesina para la formación de imágenes ópticas. Después de la irradiación láser, la presencia del nanosistema en las células provocó un aumento significativo de la temperatura del medio (46.8 ◦ C, comparado con 39.1 ◦ C sin DenAuNP-Folato-Bombesina, p < 0.05), lo que resultó en una disminución significativa en la viabilidad celular (Hasta 16.51 ± 1.52 %) debido a las propiedades plasmónicas del 177LuDenAuNP-Folato-Bombesina. Después del tratamiento con el radiofármaco, la viabilidad celular T47D disminuyó 90 % debido a la dosis absorbida por radiación (63.16 ± 4.20 Gy) administrada dentro de las células. Se concluye que el 177Lu-DenAuNP-Folate-Bombesina internalizado en células de cáncer presenta propiedades adecuadas para la obtención de imágenes ópticas, terapia fototérmica-plasmónica y radioterapia dirigida.CONACYT (CONACYT-SEP-CB-2014-01-242443

IMPORTANCIA DE LA EVALUACIÓN DE LA CROMATINA ESPERMÁTICA EN RUMIANTES. UNA REVISIÓN / IMPORTANCE OF SPERM CHROMATIN EVALUATION IN RUMINANTS. A REVIEW

During spermatogenesis, the sperm nucleus undergoes a series of important changes that make of the chromatin a unique structure, whose quality is a determining factor of sperm ability to promote normal embryonic development and it is consequently related to fertility. Several factors could affect the integrity of sperm chromatin and thus affect the fertility, having consequences for the offspring. Despite this and the availability of techniques, evaluation of the sperm chromatin quality is not part of the tests performed routinely at the field or laboratory to estimate sperm quality or the fertility of bulls, and this may be limiting the efficiency of embryos production systems and the artificial insemination with the consequent reduction in profitability. In this review, some of the factors that may affect the integrity of sperm chromatin and how damage to this structure affects reproductive efficiency and progeny are discussed; in addition, some alternatives that could be useful to reduce the incidence of sperm with damaged chromatin, with special emphasis on ruminants are presented.RESUMENDurante la espermatogénesis el núcleo espermático sufre una serie de cambios importantes que hacen de la cromatina una estructura única cuya calidad es un factor determinante de la capacidad espermática para promover el desarrollo embrionario normal y que consecuentemente está relacionada con la fertilidad. Diversos factores pueden afectar la integridad de la cromatina espermática y por ende afectar la fertilidad teniendo consecuencias sobre la progenie. A pesar de esto y de la disponibilidad de técnicas, la evaluación de la calidad de la cromatina espermática no forma parte de la batería de pruebas que se realizan tanto a nivel de campo como en laboratorio, para estimar la calidad espermática y el potencial reproductivo de los toros, y esto puede estar limitando la eficiencia de los sistemas de producción de embriones y de la inseminación artificial con la consecuente disminución de la rentabilidad. En esta revisión se discuten algunos de los factores que pueden afectar la integridad de la cromatina espermática y como el daño a esta estructura afecta la eficiencia reproductiva y a la progenie; además, se presentan algunas alternativas que pudiesen ser útiles a fin de disminuir la incidencia de espermatozoides con daño en la cromatina, con especial énfasis en rumiantes.

Theoretical and experimental characterization of emission and transmission spectra of Cerenkov radiation generated by 177Lu in tissue

Cerenkov radiation (CR) is the emission of UV-vis light generated by the de-excitation of the molecules in the medium, after being polarized by an excited particle traveling faster than the speed of light. When β particles travel through tissue with energies greater than 219 keV, CR occurs. Tissues possess a spectral optical window of 600 to 1100 nm. The CR within this range can be useful for quantitative preclinical studies using optical imaging and for the in-vivo evaluation of 177Lu-radiopharmaceuticals (β-particle emitters). The objective of our research was to determine the experimental emission light spectrum of 177Lu-CR and evaluate its transmission properties in tissue as well as the feasibility to applying CR imaging in the preclinical studies of 177Lu-radiopharmaceuticals. The theoretical and experimental characterizations of the emission and transmission spectra of 177Lu-CR in tissue, in the vis-NIR region (350 to 900 nm), were performed using Monte Carlo simulation and UV-vis spectroscopy. Mice 177Lu-CR images were acquired using a charge-coupled detector camera and were quantitatively analyzed. The results demonstrated good agreement between the theoretical and the experimental 177Lu-CR emission spectra. Preclinical CR imaging demonstrated that the biokinetics of 177Lu-radiopharmaceuticals in the main organs of mice can be acquiredThis study was supported by the Mexican National Council of Science and Technology (CONACYT) through the CATEDRAS-CONACYT-ININ-337 and CONACYT-SEP-CB- 2016-286753 projects. It was carried out as part of the activities of the “Laboratorio Nacional de Investigación y Desarrollo de Radiofármacos, CONACyT (LANIDER-CONACYT)” and the Red-Biofotónica, CONACYT. The financial support of the SIEA-UAEMex through the Grant No 4348/2017/CI is also acknowledged