Inverse baseline expression pattern of the NEP/neuropeptides and NFκB/proteasome pathways in androgen-dependent and androgen-independent prostate cancer cells

<p>Abstract</p> <p>Background</p> <p>Castration-resistance in prostate cancer (PC) is a critical event hallmarking a switch to a more aggressive phenotype. Neuroendocrine differentiation and upregulation of NFκB transcriptional activity are two mechanisms that have been independently linked to this process.</p> <p>Methods</p> <p>We investigated these two pathways together using <it>in vitro </it>models of androgen-dependent (AD) and androgen-independent (AI) PC. We measured cellular levels, activity and surface expression of Neutral Endopeptidase (NEP), levels of secreted Endothelin-1 (ET-1), levels, sub-cellular localisation and DNA binding ability of NFκB, and proteasomal activity in human native PC cell lines (LnCaP and PC-3) modelling AD and AI states.</p> <p>Results</p> <p>At baseline, AD cells were found to have high NEP expression and activity and low secreted ET-1. In contrast, they exhibited a low-level activation of the NFκB pathway associated with comparatively low 20S proteasome activity. The AI cells showed the exact mirror image, namely increased proteasomal activity resulting in a canonical pathway-mediated NFκB activation, and minimal NEP activity with increased levels of secreted ET-1.</p> <p>Conclusions</p> <p>Our results seem to support evidence for divergent patterns of expression of the NFκB/proteasome pathway with relation to components of the NEP/neuropeptide axis in PC cells of different level of androgen dependence. NEP and ET-1 are inversely and directly related to an activated state of the NFκB/proteasome pathway, respectively. A combination therapy targeting both pathways may ultimately prove to be of benefit in clinical practice.</p

Study of immunological mechanisms in lung parenchyma

Ο σκοπός της μελέτης ήταν ο προσδιορισμός της ανοσολογικής κατάστασης μακροφάγων και μονοκυττάρων του αίματος ασθενών με πρωτογενές και δευτερογενές ARDS και ο προσδιορισμός του φλεγμονώδους καθεστώτος τόσο τοπικά στο πνευμονικό παρέγχυμα, όσο και συστημικά στην κυκλοφορία του αίματος. Για τον σκοπό αυτό πραγματοποιήθηκαν: 1) Προσδιορισμοί πρωτεϊνών, ολικού φωσφόρου, φλεγμονωδών και αντί-φλεγμονωδών δεικτών και επιπέδων της SP-A σε BAL και ορούς ασθενών με πρωτογενές και δευτερογενές ARDS. 2) Απομόνωση και ενεργοποίηση κυψελιδικών μακροφάγων και μονοκυττάρων του αίματος και προσδιορισμός των επιπέδων φωσφολιπάσης Α₂ και PAF-ακετυλυδρολάσης. 3) Χαρακτηρισμός των ισοενζύμων της φωσφολιπάσης Α₂ τόσο σε βιολογικά υγρά όσο και σε κυτταροκαλλιέργειες. 4) Μελέτη της έκφρασης των υποδοχέων Toll-like 4. 5) Προσδιορισμοί των επιπέδων φλεγμονωδών και αντί-φλεγμονωδών μεσολαβητών μετά από επίδραση σε κυψελιδικά μακροφάγα φυσικού τροποποιημένου επιφανειοδραστικού παράγοντα. Τα ευρήματα της μελέτης συνοψίζονται στα εξής: 1) Βρέθηκε ότι το υγρό βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με ARDS περιέχει αυξημένα επίπεδα ουδετερόφιλων κυττάρων, πρωτεϊνών και φλεγμονωδών μεσολαβητών όπως η φωσφολιπάση Α₂. Παράλληλα βρέθηκαν αυξημένα επίπεδα του αντί-φλεγμονώδους μεσολαβητή PAF-AcH. Όλα τα παραπάνω ευρήματα είναι ενδεικτικά της ύπαρξης φλεγμονώδους περιβάλλοντος στο πνευμονικό παρέγχυμα. Παράλληλα η συγκέντρωση ολικού λιπιδικού φωσφόρου βρέθηκε μειωμένη εν αντιθέσει των επιπέδων της επιφανειοδραστικής πρωτεΐνης SP-A, υποδηλώνοντας διαταραχές στην σύσταση και λειτουργία του επιφανειοδραστικού παράγοντα. Στην περίπτωση δευτερογενούς ARDS, τα επίπεδα της PAF-AcH βρέθηκαν μειωμένα στον ορό ασθενών, με ταυτόχρονη μείωση της συγκέντρωσης των πρωτεϊνών, ενώ ανιχνεύθηκαν υψηλά επίπεδα της SP-A. Τα αποτελέσματα αυτά μαρτυρούν τον συστημικό χαρακτήρα της νόσου. 2) Όσον αφορά την ανοσολογική κατάσταση των κυψελιδικών μακροφάγων, βρέθηκε ότι σε ασθενείς με ARDS, πρωτογενές και δευτερογενές, τα κύτταρα βρίσκονται σε κατάσταση ανοχής και δεν αποκρίνονται σε φλεγμονώδη ερεθίσματα, αφού δεν παρατηρήθηκε καμία μεταβολή των επιπέδων των μεσολαβητών τόσο απουσία όσο και παρουσία ενεργοποιητών. Μονοκύτταρα ασθενών με δευτερογενές ARDS, επίσης δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή των επιπέδων της ενδοκυττάριας PLΑ₂. 3) Σε βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα ασθενών με ARDS πραγματοποιήθηκε ανίχνευση των ισομορφών του ενζύμου και ταυτοποιήθηκαν ως εκκρινόμενες φωσφολιπάσες τόσο τύπου ΙΙΑ, όσο και τύπου V, ενώ στον ορό ασθενών ανιχνεύθηκαν επίπεδα εκκρινόμενων φωσφολιπασών τύπου ΙΙA, V και X, ωστόσο μόνο η sPLΑ₂ τύπου ΙΙΑ είχε θετική συσχέτιση με την εμφάνιση της νόσου. Σε κυψελιδικά μακροφάγα ασθενών με ARDS βρέθηκαν υψηλά επίπεδα ενεργοποιημένης κυτοσολικής PLΑ₂ τόσο παρουσία όσο και απουσία ενεργοποιητών, ενώ εκκρινόμενη PLΑ₂ τύπου ΙΙΑ βρέθηκε κατά την επώαση με LPS. Σε μονοκύτταρα ασθενών με δευτερογενές ARDS παρατηρήθηκε το ίδιο ανοσολογικό προφίλ. 4) Όσον αφορά τον υποδοχέα TLR-4, βρέθηκε αύξηση της έκφρασης αυτού τόσο σε κυψελιδικά μακροφάγα όσο και σε μονοκύτταρα του αίματος, στην ομάδα ελέγχου, μετά από επίδραση LPS και IFN-γ. Σε μονοκύτταρα δευτερογενούς ARDS όμως, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης του υποδοχέα μετά από επίδραση του LPS. 5) Η χορήγηση τροποποιημένου φυσικού επιφανειοδραστικού παράγοντα είχε ως αποτέλεσμα την μείωση τόσο των φλεγμονωδών όσο και των αντί-φλεγμονωδών μεσολαβητών και στις δυο ομάδες

MGMT repletion after treatment of glioblastoma cells with temozolomide and O6-benzylguanine implicates NF kappa B and mutant p53

The DNA repair enzyme O6-methylguanine methyltransferase (MGMT) is a major determinant of glioma resistance to alkylating agents. Several strategies have been used to induce sensitization to alkylator-based treatments, including the direct MGMT inhibitor O6-benzylguanine (BG). However, replenishment of MGMT is often observed after the withdrawal of combined schedules of temozolomide (TMZ) and BG, thus preventing further treatment efficacy. In this study we investigated the potential mechanisms of resistance to combination treatment with TMZ and BG in the MGMT-proficient, p53-mutated (mt p53) T98G glioblastoma (GBM) cell line, looking for an effect on nuclear factor kappa B (NF kappa B) and mt p53, which are both transcriptional regulators of MGMT. The administration of TMZ alone led to minimal inhibition of T98G cell viability which was, however, enhanced with the addition of BG. This effect coincided with reduced expression of MGMT protein and transcript levels, and a decrease in cellular amount of NF kappa B and mt p53. However, withdrawal of the drugs led to an increase in cell viability, which was in parallel with repletion of MGMT protein and transcript levels and was also accompanied by elevated protein levels of NF kappa B and mt p53. Overall, these results suggest that NF kappa B and mt p53 induction may be responsible for the failure of BG to induce prolonged inhibition of direct repair in TMZ co-treated GBM cells with mt p53 status

Bortezomib Downregulates MGMT Expression in T98G Glioblastoma Cells

The efficacy of treatment for glioblastoma multiforme is currently limited by the development of resistance, particularly, but not exclusively, due to the expression of the DNA repair enzyme O6-methylguanine methyltransferase (MGMT) in a significant proportion of astrocytic tumors. MGMT is post-translationally regulated by the 26S proteasome, a multi-subunit organelle responsible for degradation of misfolded cellular proteins. The boronic acid dipeptide bortezomib is the first and only proteasome inhibitor in clinical use so far, and has been reported as a strategy to restrict growth and promote apoptosis of glioblastoma cells. In this study we investigated the effect of bortezomib on MGMT expression in T98G cells, looking for an effect on the nuclear factor kappa B (NF kappa B) pathway, which is a major player in MGMT regulation and is also under tight control by the ubiquitin-proteasome system. Administration of bortezomib led to a significant reduction of T98G cell viability and induction of DNA fragmentation. These effects coincided with reduced expression of MGMT transcript levels, and a decrease in cellular amount and I kappa B alpha-mediated, proteasomal activity-dependent nuclear translocation of NF kappa B. In addition, bortezomib-induced phosphorylation of the translation initiation factor 2alpha (eIF2 alpha) was in parallel with translational repression of MGMT. Taken together, these results suggest a novel role for bortezomib as a potent MGMT inhibitor and support its ongoing testing as a chemosensitizer in glioblastoma

Bortezomib overcomes MGMT-related resistance of glioblastoma cell lines to temozolomide in a schedule-dependent manner

Development of drug resistance after standard chemotherapy for glioblastoma multiforme (GBM) with temozolomide (TMZ) is associated with poor prognosis of GBM patients and is at least partially mediated by a direct DNA repair pathway involving O6-methylguanine methyltransferase (MGMT). This enzyme is under post-translational control by a multisubunit proteolytic cellular machinery, the 26S proteasome. Inhibition of the proteasome by bortezomib (BZ), a boronic acid dipeptide already in clinical use for the treatment of myeloma, has been demonstrated to induce growth arrest and apoptosis in GBM cells. In this study we investigated the effect of sequential treatment with BZ and TMZ on cell proliferation-viability and apoptosis of the human T98G and U87 GBM cell lines. We also tested for an effect of treatment on MGMT expression and important upstream regulators of the latter, including nuclear factor kappa B (NF kappa B), p44/42 mitogen-activated protein kinase (MAPK), p53, signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3) and hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1 alpha). The sequence of drug administration for maximal cytotoxicity favored BZ prior to TMZ in T98G cells while the opposite was the case for U87 cells. Maximal efficacy was associated with downregulation of MGMT, reduced I kappa B alpha-mediated proteasome-dependent nuclear accumulation of NF kappa B, attenuation of p44/42 MAPK, AKT and STAT3 activation, and stabilization of p53 and inactive HIF-1 alpha. Collectively, these results suggest that proteasome inhibition by BZ overcomes MGMT-mediated GBM chemoresistance, with scheduling of administration being critical for obtaining the maximal tumoricidal effect of combination with TMZ