28 research outputs found

    Characterization of putative immune evasion mechanisms of feline infectious peritonitis virus

    Get PDF
    Er bestaan twee types feliene coronavirussen: het felien enterisch coronavirus, of FECV, en het felien infectieuze peritonitis virus, of FIPV. Meestal gaat een FECV infectie onopgemerkt voorbij maar soms muteert FECV naar zijn hoog virulente tegenhanger: FIPV. Een infectie met FIPV veroorzaakt een chronische, meestal fatale peritonitis/vasculitis. Na decennia van onderzoek is het nog steeds niet geweten hoe FIPV een zo hevige ziekte kan opwekken en waarom het immuunsysteem van een kat een infectie niet kan overwinnen. Alhoewel de interacties tussen FIPV en het immuunsysteem van de gastheer nog slecht gekend zijn, is het duidelijk dat FIPV over een of meer immuno-evasie mechanismen moet beschikken. Daarom was het doel van deze thesis om de interacties van FIPV (en FECV) met de in vivo doelwitcel van FIPV, de feliene monocyt, te onderzoeken en om mogelijke immuno-evasie mechanisme(n) te identificeren en te karakteriseren. In eerste instantie werden de infectiekinetieken van FIPV bepaald in de in vivo doelwitcel, de monocyt. Verrassend genoeg werden drie infectiepatronen waargenomen, afhankelijk van de kat waaruit de monocyten waren geïsoleerd. In de monocyten van de eerste groep verliep een FIPV infectie progressief; in de tweede groep werden de monocyten wel geïnfecteerd maar de infectie was van korte duur; de monocyten van de derde groep waren niet vatbaar voor infectie. Daarentegen vertoonde FECV een gebrek aan lange termijn infectie en virusproductie, wat aan de basis kan liggen van het verschil in pathogenese bij FIPV en FECV. Een andere belangrijke observatie was dat ongeveer 50% van de FIPV (en FECV) geïnfecteerde monocyten de virale proteïnen efficiënt weerhield binnenin de cel. Deze intracellulaire retentie kan een immuno-evasie mechanisme zijn aangezien het antistof-afhankelijke herkenning van geïnfecteerde cellen kan verhinderen. Vervolgens werd bestudeerd wat er gebeurt met de 50% geïnfecteerde cellen die wel virale proteïnen tot expressie brengen, in de aanwezigheid van antistoffen. We zagen dat de membraan-gebonden virale eiwitten geïnternaliseerd werden via een heel efficiënt en snel proces waardoor er niet langer visueel detecteerbare antigenen aanwezig waren op de plasmamembraan. Deze antistof geïnduceerde internalisatie kan verklaren waarom de humorale immuunrespons niet werkzaam is tegen een FIPV infectie en is dus een mogelijk immuno-evasie mechanisme. In een derde deel werd de internalisatieweg en het erop volgende transport van de antigeen-antistof complexen gekarakteriseerd met behulp van biochemische, celbiologische en genetische methoden. Internalisatie in een cel kan op verscheidene manieren gebeuren. Er zijn 4 “klassieke” internalisatie wegen: fagocytose, macropinocytose, clathrine gemedieerde internalisatie en caveolae gemedieerde internalisatie en 4 minder goed gedefinieerde “niet-klassieke” internalisatie wegen. Er werd aangetoond dat de hier bestudeerde internalisatie weg onafhankelijk was van actine, clathrine, caveoline, rafts, dynamine, rho-GTPasen en fosfatidylinositol 3-kinase. Dit houdt in dat de antigeen-antistof complexen niet via één van de gekende internalisatie wegen geïnternaliseerd word, maar via een nieuwe weg. Aan de hand van colokalisatiekleuringen werd er verder aangetoond dat de antigeen-antistof com-plexen na internalisatie via de vroege en de late endosomen naar een niet-lysosomaal compartiment getransporteerd werden. Karakterisering toonde aan dat internalisatie en intracellulair transport afhankelijk waren van microtubuli maar niet van actine polymerisatie. Tenslotte werd onderzocht hoe de internalisatie en daaropvolgend intracellulair transport wordt gereguleerd. Dit werk werpt een nieuw licht op de pathogenese van FIP en opent perspectieven op het vinden van een nieuwe therapie

    Generation and characterization of feline arterial and venous endothelial cell lines for the study of the vascular endothelium

    Get PDF
    Background: The in vitro culture of endothelial cells (ECs) is an indispensable tool for studying the role of the endothelium in physical and pathological conditions. Primary ECs, however, have a restricted proliferative lifespan which hampers their use in long-term studies. The need for standardized experimental conditions to obtain relevant and reproducible results has increased the demand for well-characterized, continuous EC lines that retain the phenotypic and functional characteristics of their non-transformed counterparts. Results: Primary feline ECs from aorta and vena cava were successfully immortalized through the successive introduction of simian virus 40 large T (SV40LT) antigen and the catalytic subunit of human telomerase (hTERT). In contrast to the parental ECs, the transformed cells were able to proliferate continuously in culture. Established cell lines exhibited several inherent endothelial properties, including typical cobblestone morphology, binding of endothelial cell-specific lectins and internalization of acetylated low-density lipoprotein. In addition, the immortalization did not affect the functional phenotype as demonstrated by their capacity to rapidly form cord-like structures on matrigel and to express cell adhesion molecules following cytokine stimulation. Conclusion: The ability to immortalize feline ECs, and the fact that these cells maintain the EC phenotype will enable a greater understanding of fundamental mechanisms of EC biology and endothelial-related diseases. Furthermore, the use of cell lines is an effective implementation of the 3-R principles formulated by Russel and Burch

    Porcine Sialoadhesin (CD169/Siglec-1) Is an Endocytic Receptor that Allows Targeted Delivery of Toxins and Antigens to Macrophages

    Get PDF
    Sialoadhesin is exclusively expressed on specific subpopulations of macrophages. Since sialoadhesin-positive macrophages are involved in inflammatory autoimmune diseases, such as multiple sclerosis, and potentially in the generation of immune responses, targeted delivery of drugs, toxins or antigens via sialoadhesin-specific immunoconjugates may prove a useful therapeutic strategy. Originally, sialoadhesin was characterized as a lymphocyte adhesion molecule, though recently its involvement in internalization of sialic acid carrying pathogens was shown, suggesting that sialoadhesin is an endocytic receptor. In this report, we show that porcine sialoadhesin-specific antibodies and F(ab')2 fragments trigger sialoadhesin internalization, both in primary porcine macrophages and in cells expressing recombinant porcine sialoadhesin. Using chemical inhibitors, double immunofluorescence stainings and dominant-negative constructs, porcine sialoadhesin internalization was shown to be clathrin- and Eps15-dependent and to result in targeting to early endosomes but not lysosomes. Besides characterizing the sialoadhesin endocytosis mechanism, two sialoadhesin-specific immunoconjugates were evaluated. We observed that porcine sialoadhesin-specific immunotoxins efficiently kill sialoadhesin-expressing macrophages. Furthermore, porcine sialoadhesin-specific albumin immunoconjugates were shown to be internalized in macrophages and immunization with these immunoconjugates resulted in a rapid and robust induction of albumin-specific antibodies, this compared to immunization with albumin alone. Together, these data expand sialoadhesin functionality and show that it can function as an endocytic receptor, a feature that cannot only be misused by sialic acid carrying pathogens, but that may also be used for specific targeting of toxins or antigens to sialoadhesin-expressing macrophages

    Feline cell-mediated immune response against viral pathogens using 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) labeling

    No full text
    The feline immune response against viruses consists of a humoral and cellular immune response. At present, four immune parameters can be monitored by flowcytometry in order to evaluate the CMI: activation-proliferation, cytokine-production, cytotoxicity and receptor-detection. In this study, the lymphocytic proliferative response to infectious and inactivated virus (feline calicivirus (FCV), feline parvovirus (FPV) and feline herpesvirus 1 (FHV)) was investigated in vitro by using 5-bromo-2’-deoxyuridine (BrdU) labeling in combination with a double staining (CD3 - CD8) and subsequent flow cytometrical analysis to specifically identify the subset of proliferating T cells. Macrophages (MΦ) and monocyte derived dendritic cells (mDC) were used as antigen presenting cells (APC). Additionally, the production of interferon-γ, the signature molecule of Th1 cells, was evaluated in cell culture supernatant using an enzyme-linked immune sorbent assay (ELISA). Briefly, feline MΦ and mDC from FCV/FPV/FHV-vaccinated cats were incubated with several infectious viruses (FCV, FHV and FPV) and with equivalent amounts of inactivated virus. After washing, the cells were further incubated with 1.105 ml-1 autologous lymphocytes for 4 days at 37°C, 5% CO2. Cells were then stained for proliferation with BrdU and against CD3 and CD8 with specific monoclonal antibodies to identify the proliferating cell population. With mDC as APC, significant proliferation signals (comparable to mitogen treated lymphocytes) were seen when adding inactivated FCV, FHV and FPV. When adding infectious virus, severe proliferation suppression was seen with FPV and FHV in comparison with inactivated virus. Infectious FCV induced a proliferation equivalent to that of inactivated virus. The distribution of all signals was comparable between the CD8+ and CD8- lymphocyte population (Figure 1a). When MΦ were used as APC, both CD8+ and CD8- lymphocyte populations did not show any significant proliferation when incubated with infectious and inactivated virus, with the exception of inactivated calicivirus which gave a 12.2% proliferation signal in the CD8- lymphocyte population (Figure 1b). Additionally, the IFN-γ concentrations found in the culture supernatant concurred well with the amount of proliferation of the DC-stimulated lymphocytes (Figure 1c), validating this technique as a tool for studying the feline CMI against viruses. Figure 1: Percentage proliferating lymphocytes (CD3+) in response to antigen stimulated dendritic cells (DC) (a) and macrophages (MΦ) (b) as APC. (c) IFN-γ concentration in supernatant of lymphocytes in (a). To the author’s knowledge this is the first time that the BrdU technique was used in combination with MΦ and mDC as APC and both infectious and inactivated virus in order to evaluate the CMI of individual cats upon virus vaccination and subsequent viral infection in vitro
    corecore