Ein HTS-Phosphorylierungs-Assay mittels Reflektometrischer Interferenzspektroskopie

Die Phosphorylierung ist ein übliches Verfahren zur Charakterisierung von Kinasen und geeigneten Substraten. Für die pharmazeutische Industrie sind neue Verbindungen von Interesse, die in der Lage sind, die Phosphorylierungsaktivität solcher Kinasen zu hemmen. Das Hochdurchsatzscreening hilft bei der Suche nach solchen Inhibitoren. Mit herkömmlichen Methoden wird die Menge des phosphorylierten Proteins bei einer Aktivitätsstudie durch den Einbau von radioaktivem Phosphor bestimmt. Anhand des Ausmaßes der Phosphorylierung kann auf die inhibierende Wirkung der untersuchten Substanzen geschlossen werden. Der Nachweis der Phosphorylierung mit einer markierungsfreien Methode wie der Reflektometrischen Interferenzspektroskopie (RIfS) bedeuten den angestrebten Verzicht auf den Umgang mit radioaktiven Isotopen und machen die Markierung als zusätzlichen Arbeits- und Kostenpunkt überflüssig. Die Reflektometrische Interferenzspektroskopie stellt eine neuartige Methode zur markierungsfreien Messung von Interaktionen zwischen ausreichend großen Reaktionspartnern dar. Mit Ihrer Hilfe kann die spezifische Bindung an eine Sensoroberfläche über den Zuwachs der optischen Schichtdickenänderung ausreichend schnell, reproduzierbar und zuverlässig untersucht werden. Dabei besteht mit Hilfe des hier verwendeten Prototyps die Möglichkeit, in einer Mikrotiterplatte 96 Wells simultan zu vermessen und somit ein Screening von Substanzbibliotheken durchzuführen

Librarian - Phase 2. Teilprojekt: Anwendung des Verfahrens der Reflektometrischen Schichtdickenmessung zur Signaldetektion in biologischen Testsystemen und Festphasensynthesen Schlussbericht

Label free methods that do not require fluorescence markers or radioactive isotopes are of interest for high throughput screening applications. Thus, a new assay type for the RIfS technology was developed. These phosphorylation assay experiments were tested for reproducibility and were validated, initially using a single channel machine. The use of surface active materials to reduce or eliminate non specific binding is recommended. The non specific binding of the individual reagents was an important factor for their integration in the RIfS method. The immobilisation of binding reagents was tested using various methods. Since the various combinations are essentially limitless, they could not be explored to their full extent within the confines of this project. The application of the assay into microtitre plate format was not fully completed within the time frame allotted, however, has since been completed by one of the project participants as part of a further cooperation. Theoretically, this method is also suited to the robotics and sample throughput integral to a HTS system A comprehensive evaluation of RIfS technology regarding its entry into high throughput screening, however can only be made with reservation, due to the limited experience with its use in 96 and 384 microtitre plates. (orig.)SIGLEAvailable from TIB Hannover: F02B1390 / FIZ - Fachinformationszzentrum Karlsruhe / TIB - Technische InformationsbibliothekBundesministerium fuer Bildung und Forschung, Berlin (Germany)DEGerman