Miozin motorfehérjék: szerkezet-funkció összefüggések és funkcionális vizsgálatok idegsejteken = Myosin motor proteins: structure-function relationship and functional studies in neurons

Kutatómunkánk elsődlegesen a miozin motorfehérjék szerkezet-funkció vizsgálatára irányult. Meghatároztuk a konvencionális miozin (miozin-II) fej szerkezetét az enzimatikus ciklus egy ez idáig nem ismert állapotában. A szerkezet rávilágított a kémiai energiát munkává alakító „négyütemű” motor működésének több kulcsfontosságú elemére. Azonosítottunk a motor doménen belül egy kölcsönhatást, amely hozzájárulhat a különböző miozinok optimális működéséhez. Kiderítettük, hogy a fej-farok kapcsolódás instabil szerkezetű a közvetlenül szabályozott miozin-II motoroknál. A miozin-VI farok régiójáról megmutattuk, hogy egyszálú ?-hélix (CSAH) szerkezetű. Új szerkezetjósló programokkal megállapítottuk, hogy a CSAH egy eddig fel nem ismert, sok fehérjében megtalálható szerkezeti elem, amely mechanikai szerepet tölthet be. A miozin-V intracelluláris transzport folyamatokban betöltött szerepét élő idegsejteken kezdtük el vizsgálni. A miozin-V farok könnyű lánc (DYNLL) kötőhelyét azonosítottuk a nehéz láncon belül. Kimutattuk, hogy a DYNLL egy konzervatív ún. csomóponti fehérje, amely a kölcsönható fehérjék szerkezet nélküli régiójában elhelyezkedő lineáris motívumokhoz kötődik és így szabályozza őket. Jellemeztük a DYNLL-partner komplexek kialakulásának termodinamikáját és kinetikáját. Irányított evolúció segítségével az eddig ismerteknél erősebb kötőszekvenciát állítottunk elő, s bioinformatikai módszerrel további potenciális partnerfehérjéket azonosítottunk a humán proteomban. | We have primarily pursued structure-function studies of myosin motor proteins. We have determined the 3-dimensional structure of conventional myosin (myosin II) in one state of its enzymatic cycle. The structure highlighted some of the key elements during the chemo-mechanical energy transduction of the “4-stroke” motor. We have identified an interaction within the motor domain of which could contribute to the optimal functioning of different myosins. Comparative studies revealed that the structure of the coiled-coil tail at the head-tail junction is unstable in directly regulated myosin IIs. We have shown that the tail region of myosin VI forms a single ?-helix (CSAH). Using newly developed prediction programs we have found that CSAH is a novel structural motif present in a many proteins and that it could play mechanical roles. We have started to investigate the role of myosin V in intracellular transport of neuronal cells by live-cell imaging. We have localized the binding site of the tail light chain (DYNLL) of myosin V. DYNLL was identified as a conserved hub protein that binds to linear motifs localized in disordered regions of their binding partners and hence regulate them. We have determined the thermodynamic and kinetic properties of DYNLL-partner complexes. Using directed evolution we have selected a stronger DYNLL binding peptide than previously known ones, and we have predicted potentially novel binding partners in the human proteome

A fehérje-fehérje kölcsönhatások szerkezeti alapjai és biológiai szerepük: multidiszciplináris megközelítés = The structural basis and biological role of protein-protein interactions: a multidisciplinary approach

Az ELTE Biokémiai Tanszék tudományos kutatásainak tengelyében évtizedek óta a fehérjék szerkezetének, funkciójának és a fehérjék közötti kölcsönhatások szerkezeti hátterének és biológiai jelentőségének felderítése áll. Valamennyi, az elmúlt négyéves pályázati ciklusban vállalt feladatunk teljesítése a fenti célokat szolgálta. A vezető kutató megítélése szerint a pályázat támogatásával elért legkiemelkedőbb eredményeink, a vállalt témák sorrendjében a következők voltak: 1) Megállapítottuk, hogy a primata-specifikus tripszin 4 egyik, feltehetően biológiai szubsztrátja a mielin bázikus fehérje és modellt dolgoztunk ki a humán tripszinogén 4 asztroglia sejteken belüli transzportjának és aktivációjának követésére 2) Hazánkban elsőként állítottuk be a fágbemutatás módszerét, melynek segítségével az eredetitől eltérő specifitású proteáz inhibitorokat állítottunk elő. 3) Megállapítottuk, hogy a miozin II motorfehérje regulációs képességének az az előfeltétele, hogy aproximális kétláncú coiled-coil szerkezet instabil legyen. 4) Felderítettük a miozin II specifikus inhibitorának, a blebbistatinnak a működésmechanizmusát. 5) Kifejlesztettünk egy új tranziens kinetikai módszert, a ?temperature-jump/stopped flow-t a módszer alkalmazásához szükséges berendezéssel együtt. | For decades the focus of scientific interest of the Biochemistry Department, Eötvös Loránd University, Budapest has been the investigation of the structural basis and biological significance of protein-protein interactions. Our research efforts during the last 4 years were to achieve specific goals along this line. In the view of the principal investigator of this grant the most outstanding scientific results achieved, or discoveries made by using the financial means of the grant are as follows: 1) We provided indirect evidence that one of the potential pathological substrate of human trypsin 4 might be myelin basic protein. Furthermore, we worked out a model to follow the transport and activation of human trypsinogen 4 within human astroglia cells. 2) For the first time in Hungary we introduced the methodology of phage-display in our department and by using this method we succeeded in producing serine protease inhibitors with altered specificity. 3) Evidence was provided that the instability of the proximal two-chain coiled structure in myosin II plays an important regulatory role in the myosin functioning 4) The mechanism of action of the inhibitor of myosin II, blebbistatin was explored. 5) We developed and set up a new method and apparatus to perform ?temperature-jump/stopped flow? transient kinetics experiments