Interferenz in Signaltransduktionswege als therapeutischer Ansatz bei Prionkrankheiten

Prionkrankheiten sind stets tödliche, neurodegenerative, infektiöse Erkrankungen, die unterteilt werden können in sporadische, genetisch-familiäre oder erworbene Formen. Sie sind auch bekannt unter dem Namen transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSEs). Zu ihnen gehören die Creutzfeldt-Jakob Erkrankung (CJD), das Gerstmann-Sträussler-Scheinker Syndrom (GSS), Kuru, die fatale (letale) familiäre Insomnie (FFI) und die Variante der CJD (vCJD) im Menschen, Scrapie bei Schafen und Ziegen sowie die bovine spongiforme Enzephalopathie bei Rindern (BSE). Prion-Erkrankungen werden durch die Akkumulierung einer abnormal gefalteten Isoform des zellulären Prion Proteins PrPc verursacht, die PrPSc genannt wird und den Hauptbestandteil von infektiösen Prionen darstellt. Die Konversion des zellulären Prion Proteins PrPc in seine pathogene Isoform PrPSc und die Akkumulierung von aggregiertem PrPSc sind demnach wesentliche Merkmale von Prion-Erkrankungen. Auf der Suche nach Wegen für eine mögliche Therapie und/oder Prophylaxe wurde bisher eine Vielzahl von experimentellen Ansätzen durchgeführt, mit dem Ziel in die Prion-Konversion einzugreifen. In dieser Arbeit sollte der Frage nachgegangen werden, ob durch einen Eingriff in zelluläre Signaltransduktionsprozesse ein Effekt auf die Konversion von PrPc in PrPSc ausgeübt werden kann. Dafür wurde von etwa 50 verschiedenen Substanzen, die spezifische Signalwege der Zelle inhibieren, der Effekt auf die Prion-Konversion in Prion-infizierten Zellen untersucht. Der Tyrosin-Kinasen Inhibitor STI571 zeigte in diesem Screening als einzige Substanz eine sehr starke Reduktion von PrPSc. Die Konzentration, mit der eine 50 %ige Reduktion von PrPSc in Prion-infizierten Zellen erreicht werden kann (IC50), liegt bei ≤1 µM. Weitere Untersuchungen ergaben, dass der durch STI571 ausgelöste anti-Prion Effekt zeit- und dosisabhängig ist und keinen Effekt auf die Biogenese, die Lokalisierung oder die biochemischen Eigenschaften der zellulären Isoform PrPc hat. Experimente zum molekularen Wirkungsmechanismus zeigten, dass STI571 nicht die Neusynthese von PrPSc inhibiert, sondern vielmehr den lysosomalen Abbau von bereits in der Zelle vorhandenem PrPSc aktiviert. Hierbei wird die zelluläre Halbwertszeit von PrPSc, die unter normalen Umständen sehr hoch ist und bei mehr als 24 Stunden liegt, auf unter 9 Stunden reduziert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass durch STI571 nicht die allgemeine lysosomale Aktivität der Zellen erhöht wird, sondern dass es spezifisch den physiologischen Abbau von PrPSc aktiviert und dadurch die zelluläre Clearance von PrPSc erhöht. Schließlich konnte das molekulare Ziel von STI571, das spezifisch die drei Tyrosin-Kinasen c-Kit, den PDGF(platelet derived growth factor)-Rezeptor und c-Abl inhibiert, bestimmt werden. Den verschiedenen durchgeführten Untersuchungen zufolge wird die Degradierung von PrPSc durch die Inhibition der Kinase c-Abl ausgelöst. Diese Ergebnisse zeigen, dass durch Eingriffe in die zelluläre Signaltransduktion auf den Prozess der Prion-Konversion Einfluss genommen und die zelluläre Clearance von PrPSc aktiviert werden kann. Demnach stellen Signaltransduktionswege generell potentielle Ziele für Ansätze zur Prophylaxe und Therapie von Prion-Erkrankungen dar. Substanzen, die spezifisch in Signaltransduktionsprozesse der Zelle eingreifen, sind somit eine neue Klasse von Substanzen mit anti-Prion Wirkung

Identifizierung potentieller Zielgene des Transkriptionsfaktors Sp3 in vitro und in vivo

Der ubiquitär vorkommende Transkriptionsfaktor Sp3 (Specificity protein) sowie Sp1, Sp2 und Sp4 gehören zu einer Protein-Familie, die an Sequenzen auf der DNA wie die GC-Box oder die GT-Box binden. Die Proteine dieser Familie besitzen große strukturelle Gemeinsamkeiten. Ihre DNA-Bindungsdomänen am C-Terminus sind hoch konserviert und bestehen aus drei Zinkfingern von Cys2/His2-Typ. N-terminal befinden sich je zwei -bei Sp2 nur eine- glutaminreiche Regionen, die als Aktivierungsdomänen dienen. Für Sp3 existiert darüber hinaus eine weitere funktionelle Domäne zwischen den glutaminreichen Regionen und den Zinkfingern. Dieser Abschnitt wirkt als inhibitorische Domäne und ist in der Lage die Transaktivierung durch die glutaminreichen Aktivierungsdomänen zu reprimieren. Die Sp3-defizienten Tiere sterben unmittelbar nach der Geburt. Sie sind in der Embryonalentwicklung gegenüber den Wildtyp-Tieren zurückgeblieben und deutlich kleiner. Es gibt Hinweise auf eine Retardierung einzelner Organe. In histologischen Schnitten konnte gezeigt werden, daß die Zahnentwicklung in Sp3-defizienten Mäusen nicht so weit fortgeschritten ist wie bei den vergleichbaren Wildtyp-Tieren. Bei neugeborenen Mäusen konnte eine Atembewegung festgestellt werden, die jedoch nicht dazu führte, daß Luft in die Lungen der Tiere gelangte. Bei histologischen Untersuchungen konnte in der Lunge von Wildtyp-Mäusen ein weites Alveolarlumen beobachtet werden, während das Lumen in Lungen von Sp3-defizienten Mäusen eng war und das Septum zwischen den Alveolen verdickt zu sein schien. Ziel der Arbeit war es, die Expression verschiedener Gene in Sp3-defizienten und Wildtyp-Mäusen zu untersuchen, um potentielle Zielgene des Transkriptionsfaktors beschreiben zu können. Der Phänotyp der Sp3-defizienten Mäuse deutet auf Veränderungen in der Lunge hin. Auf Grund dieser Beobachtung sollte die Expression von Lungenproteinen in vivo in Sp3(-/-)-Mäusen mit der in Sp3(+/+)-Mäusen verglichen werden, um mögliche Erklärungen für den beschriebenen Phänotyp zu erhalten. In einem Versuch mit Sp3-defizienten und Wildtyp-embryonalen Maus-Stammzellen konnte ein potentielles Zielgen von Sp3 identifiziert werden: Preadipozytenfaktor-1 (Pref-1). Im Rahmen dieser Arbeit sollte überprüft werden, ob die Expression der Pref-1 mRNA in einem anderen Zellkultursystem, in Maus-Fibroblastenzellen, auch von der Anwesenheit des Transkriptionsfaktors Sp3 abhängig ist. Pref-1 spielt eine Rolle bei der Adipozytendifferenzierung. Es sollte deshalb getestet werden, ob sich Sp3-defiziente und Wildtyp-Fibroblastenzellen gleichermaßen zu Adipozyten differenzieren lassen

Uteroglobin, an apically secreted protein of the uterine epithelium, is secreted non-polarized from MDCK cells and mainly basolaterally from Caco-2 cell

AbstractA complete cDNA encoding rabbit Uteroglobin was constructed and expressed in MDCK and Caco-2 cells. The MDCK cells secrete Uteroglobin in approximately equal amounts to the apical and the basolateral side, whereas the Caco-2 cells secrete Uteroglobin mainly to the basolateral side. Both MDCK and Caco-2 cells thus secrete Uteroglobin in a non-sorted manner. It has, however, previously been shown that Uteroglobin is secreted exclusively at the apical membrane in primary cell culture of endometrial epithelial cells [S.K. Mani et al. (1991) Endocrinology 128, 1563-1573]. This suggests that either the endometrial epithelium has an apical default pathway or recognises a sorting signal not recognised by MDCK cells and Caco-2 cells. Our data thus show that a soluble molecule can be secreted at the apical, the basolateral or both membranes depending on the cell type

Specificity Protein 2 (Sp2) Is Essential for Mouse Development and Autonomous Proliferation of Mouse Embryonic Fibroblasts

BACKGROUND: The zinc finger protein Sp2 (specificity protein 2) is a member of the glutamine-rich Sp family of transcription factors. Despite its close similarity to Sp1, Sp3 and Sp4, Sp2 does not bind to DNA or activate transcription when expressed in mammalian cell lines. The expression pattern and the biological relevance of Sp2 in the mouse are unknown. METHODOLOGY/PRINCIPAL FINDINGS: Whole-mount in situ hybridization of mouse embryos between E7.5 and E9.5 revealed abundant expression in most embryonic and extra-embryonic tissues. In order to unravel the biological relevance of Sp2, we have targeted the Sp2 gene by a tri-loxP strategy. Constitutive Sp2null and conditional Sp2cko knockout alleles were obtained by crossings with appropriate Cre recombinase expressing mice. Constitutive disruption of the mouse Sp2 gene (Sp2null) resulted in severe growth retardation and lethality before E9.5. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) derived from Sp2null embryos at E9.5 failed to grow. Cre-mediated ablation of Sp2 in Sp2cko/cko MEFs obtained from E13.5 strongly impaired cell proliferation. CONCLUSIONS/SIGNIFICANCE: Our results demonstrate that Sp2 is essential for early mouse development and autonomous proliferation of MEFs in culture. Comparison of the Sp2 knockout phenotype with the phenotypes of Sp1, Sp3 and Sp4 knockout strains shows that, despite their structural similarity and evolutionary relationship, all four glutamine-rich members of the Sp family of transcription factors have distinct non-redundant functions in vivo

High glucose increases angiopoietin-2 transcription in microvascular endothelial cells through methylglyoxal modification of mSin3A

Methylglyoxal is a highly reactive dicarbonyl degradation product formed from triose phosphates during glycolysis. Methylglyoxal forms stable adducts primarily with arginine residues of intracellular proteins. The biologic role of this covalent modification in regulating cell function is not known. Here we report that in mouse kidney endothelial cells, high glucose causes increased methylglyoxal modification of the corepressor mSin3A. Methylglyoxal modification of mSin3A results in increased recruitment of O-GlcNAc-transferase, with consequent increased modification of Sp3 by O-linked N-acetylglucosamine. This modification of Sp3 causes decreased binding to a glucose-responsive GC-box in the angiopoietin-2 (Ang-2) promoter, resulting in increased Ang-2 expression. Increased Ang-2 expression induced by high glucose increased expression of intracellular adhesion molecule 1 and vascular cell adhesion molecule 1 in cells and in kidneys from diabetic mice and sensitized microvascular endothelial cells to the proinflammatory effects of tumor necrosis factor alpha. This novel mechanism for regulating gene expression may play a role in the pathobiology of diabetic vascular disease

Epigenetic Silencing of Spermatocyte-Specific and Neuronal Genes by SUMO Modification of the Transcription Factor Sp3

SUMO modification of transcription factors is linked to repression of transcription. The physiological significance of SUMO attachment to a particular transcriptional regulator, however, is largely unknown. We have employed the ubiquitously expressed murine transcription factor Sp3 to analyze the role of SUMOylation in vivo. We generated mice and mouse embryonic fibroblasts (MEFs) carrying a subtle point mutation in the SUMO attachment sequence of Sp3 (IKEE553D mutation). The E553D mutation impedes SUMOylation of Sp3 at K551 in vivo, without affecting Sp3 protein levels. Expression profiling revealed that spermatocyte-specific genes, such as Dmc1 and Dnahc8, and neuronal genes, including Paqr6, Rims3, and Robo3, are de-repressed in non-testicular and extra-neuronal mouse tissues and in mouse embryonic fibroblasts expressing the SUMOylation-deficient Sp3E553D mutant protein. Chromatin immunoprecipitation experiments show that transcriptional de-repression of these genes is accompanied by the loss of repressive heterochromatic marks such as H3K9 and H4K20 tri-methylation and impaired recruitment of repressive chromatin-modifying enzymes. Finally, analysis of the DNA methylation state of the Dmc1, Paqr6, and Rims3 promoters by bisulfite sequencing revealed that these genes are highly methylated in Sp3wt MEFs but are unmethylated in Sp3E553D MEFs linking SUMOylation of Sp3 to tissue-specific CpG methylation. Our results establish SUMO conjugation to Sp3 as a molecular beacon for the assembly of repression machineries to maintain tissue-specific transcriptional gene silencing

Ligand binding reduces SUMOylation of the peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPARγ) activation function 1 (AF1) domain.

Peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARγ) is a ligand-activated nuclear receptor regulating adipogenesis, glucose homeostasis and inflammatory responses. The activity of PPARγ is controlled by post-translational modifications including SUMOylation and phosphorylation that affects its biological and molecular functions. Several important aspects of PPARγ SUMOylation including SUMO isoform-specificity and the impact of ligand binding on SUMOylation remain unresolved or contradictory. Here, we present a comprehensive study of PPARγ1 SUMOylation. We show that PPARγ1 can be modified by SUMO1 and SUMO2. Mutational analyses revealed that SUMOylation occurs exclusively within the N-terminal activation function 1 (AF1) domain predominantly at lysines 33 and 77. Ligand binding to the C-terminal ligand-binding domain (LBD) of PPARγ1 reduces SUMOylation of lysine 33 but not of lysine 77. SUMOylation of lysine 33 and lysine 77 represses basal and ligand-induced activation by PPARγ1. We further show that lysine 365 within the LBD is not a target for SUMOylation as suggested in a previous report, but it is essential for full LBD activity. Our results suggest that PPARγ ligands negatively affect SUMOylation by interdomain communication between the C-terminal LBD and the N-terminal AF1 domain. The ability of the LBD to regulate the AF1 domain may have important implications for the evaluation and mechanism of action of therapeutic ligands that bind PPARγ

Die SUMOylierung des Transkriptionsfaktors Sp3 reprimiert die Genexpression durch Rekrutierung Chromatin-modifizierender Enzyme und Ausbildung lokaler heterochromatischer Strukturen

Die posttranslationale Modifikation vieler Transkriptionsfaktoren mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein SUMO (Small Ubiquitin-like Modifier) führt oft zur transkriptionellen Repression. Der molekulare Mechanismus, wie die SUMO-Modifikation die Transkription reprimiert, war noch weitgehend unbekannt. Unter Verwendung des SUMOylierten Transkriptionsfaktors Sp3 als Modellsystem wurden in unserer Arbeitsgruppe mit Hilfe eines genomweiten RNA-Interferenz-Screens zahlreiche Proteine identifiziert, die an der SUMO-abhängigen transkriptionellen Repression beteiligt sein könnten. Ausgehend von Primärdaten des Screens wurde in der vorliegenden Arbeit für insgesamt 120 Proteine verifiziert, dass deren Depletion mittels spezifischer doppelsträngiger RNA (dsRNA) die Repression durch SUMOyliertes Sp3 partiell aufhebt. Dagegen wurde die transkriptionelle Aktivität einer SUMOylierungs-defizienten Mutante von Sp3 nicht beeinflusst. Weitere Validierungs-Experimente zeigten, dass das Chromatin-remodellierende Enzym Mi-2, das D. melanogaster Orthologe des C. elegans Proteins MEP-1 sowie das Polycomb Protein Sfmbt direkt als SUMO-abhängige transkriptionelle Korepressoren wirken: (1) Der dsRNA-vermittelte Knockdown dieser Proteine verminderte nicht die SUMOylierung von Sp3. Dies zeigt, dass Mi-2, MEP-1 und Sfmbt nicht die SUMOylierungs-Enzymatik, sondern nach der SUMO-Konjugation den Repressionsmechanismus regulieren. (2) Mi-2, MEP-1 und Sfmbt interagierten direkt mit SUMO und mit SUMO-modifiziertem Sp3 und wurden (3) SUMO-abhängig an einen Sp3-regulierten Promotor rekrutiert. (4) Die Depletion von Mi-2, MEP-1 und Sfmbt führte auch zur Aufhebung der Repression durch den SUMOylierten Transkriptionsfaktor Dorsal. Somit scheinen Mi-2, MEP-1 und Sfmbt Teil eines allgemeinen Repressionskomplexes zu sein, der von DNA-gebundenen SUMO-modifizierten Transkriptionsfaktoren rekrutiert wird. Um die mit der SUMO-abhängigen Repression einhergehenden Veränderungen der Chromatinstruktur im Säugersystem zu analysieren, wurde eine Zelllinie mit einem stabil im Genom integrierten Gal4-abhängigen Reportergen etabliert. Nach Transfektion reprimierten die SUMOylierten Gal4-Fusionsproteine von Sp3 und SF-1 (Steroidogenic Factor 1) die Transkription, während die jeweiligen SUMOylierungs-defizienten Mutanten die Transkription des integrierten Transgens aktivierten. Chromatin Immunpräzipitationen ergaben, dass durch Promotor-gebundene SUMOylierte Transkriptionsfaktoren SUMO-abhängig das Chromatin-remodellierende Enzym Mi-2, die MBT-Domänen-Proteine L3MBTL1 und L3MBTL2, die Histon-Methyltransferasen SETDB1 und SUV4-20H, die zu einer Trimethylierung von H3K9 und H4K20 führen, sowie die heterochromatischen Proteine der HP1-Familie rekrutiert werden. Diese heterochromatischen Proteine und repressiven Histon-Modifikationen waren auch auf dem endogenen Sp3-regulierten murinen Dihydrofolat-Reduktase-Promotor in embryonalen Mausfibroblasten vorhanden. Die Ausbildung der heterochromatischen Strukturen erfolgte auch hier Sp3-SUMO-abhängig; sie waren nur in Gegenwart von SUMOyliertem Wildtyp Sp3 nachzuweisen, nicht jedoch wenn eine SUMOylierungs-defiziente Mutante in Sp3-/-Zellen exprimiert wurde. Die hier dargestellten Ergebnisse zeigen, dass transkriptionell repressorisch wirkende SUMOylierte Transkriptionsfaktoren die Ausbildung einer lokalen repressiven Chromatinstruktur mit typischen Eigenschaften von kompaktiertem Heterochromatin initiieren können, die die DNA für die Komponenten der Transkriptionsmaschinerie unzugänglich macht