Evaluación del rol de genes involucrados en la tolerancia al cobre en álamo (Populus deltoides):Análisis tejido específico de la expresión del gen PdKTI3

59 p.El cobre (Cu) es un metal pesado presente en el suelo e imprescindible para una serie de procesos metabólicos a nivel celular interviniendo, por ejemplo, en procesos de óxido/reducción. Al mismo tiempo, el cobre puede ser un contaminante de importancia, como por ejemplo en zonas asociadas a la minería, en las cuales, su presencia implica riesgos y problemas para la salud humana. Así, el exceso de cobre puede ser perjudicial para la adecuada homeostasis metabólica de organismos y sistemas dependientes de éste, entre ellos, las plantas. Una forma de eliminar el exceso de cobre en el suelo es la fitorremediación, tecnología sustentable que tiene como objetivo degradar, asimilar, metabolizar o desintoxicar metales pesados o compuestos orgánicos por medio de la acción combinada de plantas y microorganismos con capacidad fisiológica y bioquímica para absorber, retener, degradar o transformar sustancias contaminantes a formas menos tóxicas. En este estudio se analizó la respuesta de una especie de álamo (Populus deltoides) frente al estrés por Cu. En particular, se evaluó la expresión del gen PdKTI3, el cual ha sido asociado a la respuesta de tolerancia al exceso de cobre en esta especie. La evaluación consideró una comparación de la expresión génica tanto en raíces como en hojas, en plantas tratadas y no tratadas con Cu y cultivadas en un sistema hidropónico. La metodología aplicada incluyó la extracción de RNA total y el uso de reacciones de PCR acoplada a transcripción reversa (RT-PCR) para obtener cDNAs y evaluar patrones de expresión génica tanto de PdKTI3 como de otros miembros de la familia génica. En términos generales, los resultados mostraron que no existe una expresión génica órgano-específica del gen PdKTI3, ya que dicho gen se expresó de manera similar en raíces y hojas. Además, PdKTI3 no se expresaría de forma selectiva en respuesta a estrés, ya que otros miembros de la familia, como PdKTI4 y PdKTI6, también mostraron un nivel de inducción significativo en plantas tratadas en condiciones similares

Generación de plantas transgénicas de Arabidopsis thaliana con el gen codificante de un inhibidor de tripsina tipo Kunitz (PdKTI3), asociado a tolerancia a exceso de cobre en álamos

72 p.El cobre es uno de los metales pesados más abundantes en Chile, el cual a su vez es considerado contaminante del medio ambiente. Por otro lado, también este es uno de los micronutrientes esenciales de las plantas, y que en exceso puede producir efectos biológicos negativos. La fitorremediación es el proceso de limpieza de terrenos contaminados mediante el uso de plantas y organismos asociados. Esta tecnología implica establecer vegetales en lugares con contaminantes, para remover o evitar su dispersión. Las plantas útiles para estos propósitos deben ser tolerantes al exceso de metales pesados. En estudios previos se demostró que álamos (Populus deltoides), especies candidatas para fitorremediación de metales pesados, expresan significativamente un gen que codifica un inhibidor de tripsina tipo Kunitz (PdKTI3) cuando son expuestas a estrés por exceso de cobre. Sin embargo, su función no es conocida. Para evaluar su rol como factor de tolerancia al exceso de dicho metal, el uso de modelos de estudio, como Arabidopsis thaliana, son importantes. Por este motivo, esta memoria tuvo como objetivo principal la transformación de dicha especie con el gen PdKTI3. Para ello se usó plantas de Arabidopsis thaliana sensibles a cobre, las cuales fueron transformadas con un vector de expresión que portaba el gen PdKTI3, mediante el método de transformación de inmersión floral (floral dip), mediado por Agrobacterium tumefaciens. El vector (pENTR+PdKTI3+pK7WGF2) fue elaborado en dos etapas mediante el sistema Gateway Cloning (Invitrogen). En la primera se produjo el vector de entrada (pENTR+PdKTI3). En la segunda, el vector de entrada fue fusionado a un vector de destinación (pK7WGF2), permitiendo la obtención del vector de expresión completo. Luego, dicho vector fue utilizado para transformar Agrobacterium tumefaciens por shock térmico, el cual fue usado en la producción de plantas de Arabidopsis thaliana transgénicas a través del método de inmersión floral. La aplicación del método de inmersión floral permitió la obtención de plantas de Arabidopsis thaliana transformadas genéticamente. Por lo que la presencia del gen PdKTI3, en el ADN de las plantas transformadas, fue confirmada. Lo que lleva a concluir que se cumplió el objetivo de este estudio y las plantas transgénicas obtenidas representan una plataforma de trabajo importante para estudios posteriores, tendientes a evaluar el rol del gen PdKTI3 en la respuesta defensiva de las plantas frente al estrés por cobre y su utilidad para sistemas de fitorremediación. /ABSTRACT:Copper is one of the most abundant heavy metals in Chile, which in turn is considered environmental pollutant. On the other hand, this also is an essential micronutrient for plants, which in excess can produce adverse biological effects. Phytoremediation is the process of cleaning up contaminated land by using plants and associated organisms. This technology involves establishing plants in places with contaminants, to remove or prevent its spread. Useful plants for this purpose must be tolerant of excess heavy metals. Previous studies showed that poplar (Populus deltoides), candidate for phytoremediation of heavy metals, significantly express a gene encoding a Kunitz trypsin inhibitor (PdKTI3) when exposed to excess copper stress. However, their function is not known. To assess your role as a factor of tolerance excess of said metal, the use of study models, such as Arabidopsis thaliana, is important. For this reason, this report's main objective was the transformation of the species with PdKTI3 gene. To do Arabidopsis thaliana plants sensitive to copper was used, which they were transformed with an expression vector carrying the gene PdKTI3 by the transformation method floral dip (floral dip) mediated by Agrobacterium tumefaciens. The vector (pENTR+pK7WGF2+PdKTI3) was prepared in two steps by the Gateway Cloning system (Invitrogen). At first there was the input vector (pENTR+PdKTI3). In the second, the input vector was fused to a destination vector (pK7WGF2), allowing obtaining full expression vector. Then he said vector was used to transform Agrobacterium tumefaciens by thermal shock, which was used in the production of transgenic Arabidopsis thaliana plants through floral dip method. Applying the floral dip method allowed the obtention of plants genetically transformed Arabidopsis thaliana. So the presence of PdKTI3 gene in DNA from the transformed plants, was confirmed. What leads to the conclusion that the objective of this study and transgenic plants obtained represent an important platform for further work, aimed at assessing the role of PdKTI3 gene in the plant defense response to stress studies fulfilled copper and useful in phytoremediation systems

Identification of genes associated with molecular mechanisms of cooper tolerance in Populus spp

188 p.El cobre (Cu) es un microelemento esencial para el desarrollo de las plantas, sin embargo, en altas concentraciones produce efectos negativos que limitan su crecimiento y sobrevivencia. El estudio de los genes que regulan los mecanismos de tolerancia y acumulacion de Cu en las plantas es importante para el mejoramiento genetico enfocado a la fitorremediacion de terrenos contaminados con este metal. Especies forestales como los Alamos (Populus spp) presentan un potencial significativo en el campo de la fitorremediacion y constituyen un interesante modelo de estudio para la investigacion con fines biotecnologicos, toda vez que se ha determinado la secuencia completa del genoma de Populus trichocarpa y que existen plataformas tecnologicas para la transformacion genetica de estas especies. A pesar de ello, la informacion referente a los mecanismos moleculares asociados a la respuesta de los Alamos frente a la exposicion a metales pesados es escasa. A traves de esta tesis se estudio la respuesta de diferentes Alamos bajo estres por exceso de Cu, con el proposito de identificar probables mecanismos moleculares asociados a la tolerancia a este metal. Plantas provenientes de distintas especies de Alamos, con diferente tolerancia al estres por Cu fueron cultivadas en sistemas hidroponicos por cuatro semanas y tratadas con Cu (10, 30 y 60 µM), en experimentos que involucraron distintos tiempos de exposicion (12, 24 y 72 h). El analisis de la distribucion del Cu en las plantas indico una acumulacion significativa en las raices. Por esta razon, el RNA obtenido de estos organos fue estudiado mediante arreglos de cDNA de 4.6 y 15 k, a fin de determinar variaciones en la acumulacion de transcritos. Tales anAlisis permitieron identificar una serie de transcritos acumulados diferencialmente, tanto de manera general, como especifica para los distintos factores evaluados. La mayor parte de los transcritos codifican proteinas de defensa contra el estres biotico, proteinas del sistema antioxidativo, relacionadas con la homeostasis de metales, el control del flujo hidrico y la formacion de pared celular, entre otros. La exprecon de transcritos de enzimas relacionadas con vias de senalizacion que involucran MAP quinasas, calcio y etileno, tambien fue alterada bajo condiciones de estres por Cu. En terminos generales, los resultados sugieren la presencia de un mecanismo primario de tolerancia basado en la exclusion de Cu, asociado a una respuesta general contra el estres oxidativo. ------------------------------------------ Copper (Cu) is an essential microelement for plants, however, high concentrations of this metal produces negative effects limiting their growth and survival. The study of genes regulating mechanisms involved in Cu accumulation and tolerance is important for the plant genetic improvement focused on phytoremediation of Cu-contaminated soils. Poplars (Populus spp) have a significant potential for phytoremediation applications and they are an interesting model for biotechnological research because the knowledge of the complete genome sequence from Populus trichocarpa and the availability of genetic transformation platforms for these species. However, information about the poplar response to exposure to heavy metals is rather scarce. In this thesis, the poplar response to Cu stress was studied in order to identify some possible molecular mechanisms underlying the Cu tolerance. Plants from poplar species with different tolerance level to Cu stress were grown in hydroponic systems during four weeks and treated with Cu (10, 30 y 60 μM) in different time-course experiments (12, 24 and 72 h of stress exposure). Since the analysis of Cu distribution in plant tissues showed a significant accumulation in roots, total RNA was isolated from this tissue and analyzed with 4.6 and 15 k cDNA-arrays for determining alterations in transcripts accumulation. Expression analysis identified a series of differentially accumulated transcripts in both, general and specific manner under the different stress conditions. Most of the transcripts encode proteins related to defense against biotic stress, antioxidant mechanisms, metal homeostasis, water flux control and cell wall formation. Expression of genes coding for proteins involved in signaling, such as MAP kinases, calcium and ethylene-related enzymes were also altered under Cu exposition. In general terms, the results suggest the action of a primary mechanism based on the Cu exclusion, associated to a general response against to oxidative stress

Análisis funcional del gen PdKTI3 de Populus deltoides. Rol de la proteína codificada en la tolerancia a exceso de cobre

109 p.Los álamos (Populus spp) han sido propuestos como especies candidatas para la fitorremediación de metales pesados en los suelos. Si bien el cobre (Cu) es un elemento traza esencial para las plantas, que participa como cofactor de muchas proteínas y desempeña un importante rol en procesos celulares, cuando está en exceso, se convierte en un elemento potencialmente tóxico. Recientemente, el análisis transcripcional de genes en álamos expuestos a exceso de Cu ha permitido identificar una serie de genes diferencialmente expresados relacionados con su respuesta frente al estrés. Entre éstos destacan genes que codifican para proteínas inhibidoras de tripsina del tipo kunitz (KTI), los que fueron significativamente inducidos por el Cu. Sin embargo, la función específica de este tipo de proteínas bajo estrés por metales pesados es muy poco conocida. En estudios previos, el gen PdKTI3 fue aislado, secuenciado, y la estructura de la proteína codificada fue modelada in silico. En ésta destacan dos putativos dominios de unión a Cu, lo que sugiere la capacidad de la proteína para quelar este metal. En ese contexto, para determinar su potencial rol en el marco de los mecanismos de tolerancia a Cu, en esta tesis se analizó funcionalmente el gen PdKTI3 y su correspondiente proteína, basándose en la hipótesis de que si PdKTI3 está asociado a la tolerancia al exceso de Cu, entonces su expresión en sistemas heterólogos sensibles debiera conferirles tolerancia a dicho metal. Para ello, se propusieron los siguientes objetivos: (1) establecer la capacidad de PdKTI3 para conferir tolerancia a Cu, mediante su expresión en sistemas heterólogos, (2) evaluar la participación de dominios de unión a Cu, presentes en la proteína PdKTI3, en la respuesta de tolerancia, y (3) establecer la localización subcelular de la proteína codificada por PdKTI3. Ensayos de transformación estable de PdKTI3 en plántulas de Arabidopsis thaliana demostraron que su expresión constitutiva confiere tolerancia a estrés por Cu, no obstante, esta tolerancia está limitada a un determinado nivel de expresión del gen. Por otro lado, considerando la estructura de PdKTI3 previamente modelada, en esta investigación, ambos sitios de unión a Cu fueron mutados in silico, sin que se observara un efecto significativo en su estructura tridimensional. Luego, el gen PdKTI3 fue modificado mediante mutagénesis 12 sitio-dirigida, y utilizado para complementar una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae) sensible a Cu (cup2Δ), mediante ensayos de tolerancia y cinética de crecimiento, en medios sólidos y líquidos, respectivamente. La evaluación del efecto de las mutaciones sobre la tolerancia al metal mostró que ambos sitios de unión son funcionales. Finalmente, la expresión transitoria de PdKTI3 en catáfilos de cebolla y células epidermales de tabaco, en conjunto con la utilización de marcadores organelo-específico, permitió precisar su ubicación subcelular. Los ensayos revelaron que PdKTI3 está localizada en la vacuola y el retículo endoplasmático, y cercanamente relacionada con la membrana plasmática. Los resultados obtenidos sugieren un nuevo papel para proteínas KTI, particularmente como elemento de interacción con Cu frente al estrés por este metal. PdKTI3 interactuaría con los iones de Cu a nivel de vacuola, compartimentalizando y confiriendo tolerancia a este metal. La caracterización de este nuevo mecanismo molecular de respuesta representa un aporte para el desarrollo de futuras aproximaciones biotecnológicas tendientes a la generación de plantas útiles para fitorremediación./ABSTRACT: Poplars (Populus spp) have been proposed as candidate species for the phytoremediation of heavy metals in soils. Although copper (Cu) is a trace element for plants, it participates as a cofactor of many proteins and plays an important role in cellular processes, when it is in excess, it becomes a potentially toxic element. Recently, the transcriptional analysis of genes in poplars exposed to Cu excess has allowed to identify a series of differentially expressed genes related to their response to stress. Among these genes are those encoding Kunitz trypsin inhibitor proteins (KTI), which were significantly up-regulated by Cu. However, the specific function of these proteins under heavy metal stress still remains almost unknown. In previous studies, the PdKTI3 gene was isolated, sequenced and the structure of the encoded protein was modeled in silico. In this stage, two putative Cu binding domains were identified, suggesting the ability of the protein to chelate this metal. In this context, in order to determine its potential role in the framework of Cu tolerance mechanisms, in this thesis the PdKTI3 gene and its corresponding protein were functionally analyzed. The underlying hypothesis considered that if PdKTI3 is associated with tolerance to excess of Cu, then its expression in sensitive heterologous systems should confer tolerance to this metal. For testing that hypothesis, the following objectives were proposed: (1) to establish the ability of PdKTI3 to confer tolerance to Cu, through its expression in heterologous systems, (2) to evaluate the participation of the Cu binding domains, of PdKTI3 protein, in the tolerance response, and (3) to define the subcellular localization of the protein encoded by PdKTI3. The stable transformation assays of PdKTI3 in Arabidopsis thaliana seedlings showed that can confer tolerance to Cu stress. However, this tolerance is limited to specific levels of gene expression. On the other hand, considering the structure of PdKTI3 previously modeled, in this research work, both Cu binding sites were mutated in silico, without a significant effect on its three-dimensional structure. Then, the PdKTI3 gene was modified by site-directed mutagenesis, and used to complement a Cu-sensitive strain of yeast (Saccharomyces cerevisiae) (cup2Δ), in solid and liquid media, characterizing its performance by tolerance and growth kinetic assays. The analysis of the effect of mutations on metal tolerance showed that both binding sites are functional. Finally, the transient expression of PdKTI3 in onion and tobacco epidermal cells, along with the use of specific organelle markers, allows to identify its subcellular location. The results indicated that PdKTI3 is found in the vacuole and the endoplasmic reticulum, and closely related to the plasma membrane. The results suggest a new role for KTI proteins, particularly as a molecule that interacts with Cu, under stress conditions. PdKTI3 would interact with Cu ions at the vacuole level, suggesting their compartmentalization and conferring tolerance to this metal. The characterization of this new molecular mechanism of response represents a support for the development of future biotechnological approaches suitable for generating phytoremediation systems