Recognition of tRNAs with a long variable arm by aminoacyl-tRNA synthetases

In prokaryotic cells three tRNA species, tRNASer, tRNALeu and tRNATyr, possess a long variable arm of 11–20 nucleotides (type 2 tRNA) rather than usual 4 or 5 nucleotides (type 1 tRNA). In this review we have summarized the results of our research on the structural basis for recognition and discrimination of type 2 tRNAs by Thermus thermophilus seryl-, tyrosyl- and leucyl-tRNA synthetases (SerRS, TyrRS and LeuRS) obtained by X-ray crystallography and chemical probing tRNA in solution. Crystal structures are now known of all three aminoacyl-tRNA synthetases complexed with type 2 tRNAs and the different modes of tRNA recognition represented by these structures will be discussed. In particular, emphasis will be given to the results on recognition of characteristic shape of type 2 tRNAs by cognate synthetases. In tRNASer, tRNATyr and tRNALeu the orientation of the long variable arm with respect to the body of the tRNA is different and is controlled by different packing of the core. In the case of SerRS the N-terminal domain and in the case of TyrRS, the C-terminal domain, bind to the characteristic long variable arm of the cognate RNA, thus recognizing the unique shape of the tRNA. The core of T. thermophilus tRNALeu has several layers of unusual base-pairs, which are revealed by the crystal structure of tRNALeu complexed with T. thermophilus LeuRS and by probing a ligand-free tRNA by specific chemical reagents in solution. In the crystal structure of the LeuRS-tRNALeu complex the unique D-stem structure is recognized by the C-terminal domain of LeuRS and these data are in good agreement with those obtained in solution. LeuRS has canonical class I mode of tRNA recognition, approaching the tRNA acceptor stem from the D-stem and minor groove of the acceptor stem side. SerRS also has canonical class II mode of tRNA recognition and approaches tRNASer from opposite, variable stem and major groove of acceptor stem site. And finally, TyrRS in strong contrast to canonical class I system has class II mode of tRNA recognition.У клітинах евкаріотів тРНК трьох специфічностей – тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr – мають довгу варіабельну гілку довжиною 11–20 нуклеотидів (2-га група тРНК) на відміну від чотирьох або п’яти нуклеотидів 1-ї групи тРНК. Підсумовано результати наших досліджень структурних основ упізнавання і дискримінації тРНК 2-ї групи серил-, тирозил- і лейцил-тРНК синтетазами з Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС і ЛейРС), отриманих методами рентгенівської кристалографії і хімічної модифікації тРНК у розчині. На сьогодні кристалічна структура відома для всіх трьох комплексів аміноацил-тРНК синтетаз з відповідними тРНК 2-ї групи, різні типи впізнавання яких обговорюються в огляді. Зокрема, особливу увагу приділено результатам аналізу впізнавання гомологічними синтетазами характерних рис просторової структури тРНК 2-ї групи. У тРНКSer, тРНКLeu і тРНКTyr орієнтація довгої варіабельної гілки відносно основного тіла тРНК відрізняється і контролюється різною упаковкою корової частини молекули. У разі СерРС N-кінцевий, а в разі ТирРС – C-кінцевий домени зв’язуються з певними структурами довгих варіабельних гілок гомологічних РНК, упізнаючи таким чином унікальну структурну форму тРНК. Корова частина тРНКLeu має кілька шарів незвичайних пар основ, виявлених при вивченні кристалографічної структури комплексу тРНКLeu з ЛейРС із T. thermophilus та при дослідженні вільної тРНК у розчині методом хімічної модифікації з використанням специфічних реагентів. У кристалографічній структурі комплексу ЛейРС-тРНКLeu унікальна будова D-стебла впізнається С-кінцевим доменом ЛейРС і ці дані добре узгоджуються з результатами, отриманими в розчині. ЛейРС притаманний канонічний для синтетаз І структурного класу тип упізнавання тРНК – з боку D-стебла і малої борозенки акцепторного стебла. Для СерРС також характерний канонічний для синтетаз ІІ структурного класу тип упізнавання тРНК – з протилежного боку, тобто з боку варіабельного стебла і великої борозенки акцепторного стебла. І, нарешті, ТирРС на відміну від канонічного для ферментів І класу типу має тип упізнавання тРНК, властивий синтетазам ІІ класу.В клетках эукариотов тРНК трех специфичностей – тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr – имеют длинную вариабельную ветку длиной 11–20 нуклеотидов (2-я группа тРНК) в отличие от четырех или пяти нуклеотидов 1-й группы тРНК. Суммированы результаты наших исследований структурных основ узнавания и дискриминации тРНК 2-й группы серил-, тирозил- и лейцил-тРНК синтетазами из Thermus thermophilus (СерРС, ТирРС и ЛейРС), полученные методами рентгеновской кристаллографии и химической модификации тРНК в растворе. На сегодня кристаллическая структура известна для всех трех комплексов аминоацил-тРНК синтетаз с соответствующими тРНК 2-й группы, разные типы узнавания которых обсуждаются в обзоре. В частности, особенное внимание уделено результатам анализа узнавания гомологичными синтетазами характерных черт пространственной структуры тРНК 2-й группы. У тРНКSer, тРНКLeu и тРНКTyr ориентация длинной вариабельной ветви относительно основного тела тРНК отличается и контролируется разной упаковкой коровой части молекулы. В случае СерРС N-концевой, а в случае ТирРС – C-концевой домены связываются с определенными структурами длинных вариабельных веток гомологичных РНК, узнавая тем самым уникальную структурную форму тРНК. Коровая часть тРНКLeu имеет несколько слоев необычных пар оснований, выявленных при изучении кристаллографической структуры комплекса тРНКLeu с ЛейРС из T. thermophilus и при исследовании свободной тРНК в растворе методом химической модификации с использованием специфических реагентов. В кристаллографической структуре комплекса ЛейРС–тРНКLeu уникальное строение D-стебля узнается С-концевым доменом ЛейРС и эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными в растворе. ЛейРС свойствен канонический для синтетаз І структурного класса тип узнавания тРНК – со стороны D-стебля и малой бороздки акцепторного стебля. Для СерРС также характерный канонический для синтетаз ІІ структурного класса тип узнавания тРНК – с противоположной стороны, т. е. со стороны вариабельного стебля и большой бороздки акцепторного стебля. И, наконец, ТирРС в отличие от канонического для ферментов І класса типа имеет тип узнавания тРНК, присущий синтетазам ІІ класса

Expression and purification of full-length Alanyl-tRNA-synthetase from Thermus thermophilus HB27

Aim. To gain insight into structural and functional properties of alanyl-tRNA,synthetase (AlaRS), we genetically engineered constructs for expression and purification of full-length AlaRS and checked its activity in aminoacylation assays. Methods. The genomic DNA for the AlaS gene from the T. thermophilus (HB 27 strain) was amplified by PCR and cloned into vectors with and without a histidine tag. To optimize conditions for the protein expression in E. coli and to develop efficient purification procedure, the molecular biology techniques were applied. AlaRS was purified by affinity and size-exclusion chromatography. The molecular weight of enzyme was determined by gel filtration. Results. The expression and purification conditions for recombinant AlaRS were optimized. Approximately 1.5 mg of the pure active recombinant enzyme can be obtained from 1 L of bacterial culture. AlaRS from T. thermophilus is a dimer in solution with an experimental MW of 204 kDa. Conclusions. The purified recombinant enzyme will be used for further studies on the functional kinetics and structure of the crystal complex with tRNA.Мета. Для детального вивчення структурних та функціональних властивостей аланіл-тРНК-синтетази (АлаРС) було створено генно-інженерну конструкцію для експресії та очищення повнорозмірної синтетази та перевірено її активність у реакції аміноацилювання. Методи. Ген AlaS з T. thermophilus (штам HB27) геномної ДНК ампліфікували за допомогою ПЛР з відповідними праймерами та клонували у вектор з та без гістидинової послідовності. Для оптимізації умов експресії білка в E.coli та розробки ефективної процедури очищення були застосовані сучасні методи молекулярної біології. AлаРС очищали методами афінної хроматографії та гель-фільтрації. Молекулярна маса ферменту визначалася на гель-фільтраційній колонці. Результати. Умови експресії та очистки рекомбінантної АлаРС були оптимізовані. Близько 1,5 мг чистого рекомбінантного активного ферменту можна одержати з 1 л бактеріальної культури. АлаРС з T. thermophilus є димером у розчині з експериментальною масою 204 кДа. Висновки. Отриманий рекомбінантний фермент буде використовуватися для подальших експериментів з функціональної кінетики та структурних досліджень кристалічного комплексу з тРНК.Цель. Для детального изучения структурных и функциональных свойств аланил-тРНК-синтетазы (АлаРС) было создано генно-инженерную конструкцию для экспрессии и очистки полноразмерной синтетазы и проверено ее активность в реакции аминоацилирования. Методы. Ген аlaS из геномной ДНК T. thermophilus (штамм HB27) амплифицировали с помощью ПЦР с соответствующими праймерами и клонировали в вектор с и без гистидиновой последовательностью. Для оптимизации условий экспрессии белка в E. coli и разработки эффективной процедуры очистки были применены современные методы молекулярной биологии. AлаРС очищали методами аффинной хроматографии и гель-фильтрации. Молекулярная масса фермента определялась на гель-фильтрационной колонке. Результаты. Условия экспрессии и очистки рекомбинантной АлаРС были оптимизированы. Около 1,5 мг чистого рекомбинантного активного фермента можно получить с 1 л бактериальной культуры. АлаРС с T. thermophilus является димером в растворе с экспериментальной массой 204 кДа. Выводы. Полученный рекомбинантный фермент будет использован для дальнейших экспериментов с функциональной кинетики и структурных исследований кристаллического комплекса с тРН

Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus. Purification and some properties of the crystallizing enzyme

Leucyl-tRNA synthetase from Thermus thermophilus (LeuRSTT) was purified to homogeneity using a five-step purification procedure. The enzyme was characterized and crystallized. Molecular mass determinations of the native and denatured proteins indicate monomeric structure of LeuRSTT with the molecular mass of about 101 kDa. The protein obtained is remarkably thermostable and retains 97 % of its initial aminoacylation activity after 1 hour of incubation at 88 °C. Crystals of LeuRSTT were obtained from ammonium sulfate solution by the vapour diffusion techniques. The crystals quality was improved by crystallization from the precipitate.Лейцил-тРНК синтетаза из Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) выделена в гомогенном состоянии с использованием пяти стадий очистки. Фермент охарактеризован и получены его кристаллы. Определена молекулярная масса нашивного и дена­турированного белка. Установлено, что ЛейРСТТ представ­ляет собой мономер с молекулярной массой 101 кДа. Получен­ный фермент обладает значительной термостабильностью и сохраняет 97 % аминоацилирующей активности после инкуба­ции в течение 1 ч при температуре 88 °С. Кристаллы ЛейРСТТ получены методом диффузии паров с использованием в качестве осадителя раствора сульфата аммонияЛейцил-тРНК синтетазу із Thermus thermophilus (ЛейРСТТ) виділено в гомогенному стані з використанням п'яти стадій очищення. Фермент охарактеризовано та отримано його кристали. Визначено молекулярну масу нативного і денатуро­ваного білка. Встановлено, що ЛейРСТТ являє собою мономер з молекулярною масою 101 кДа. Отриманому ферментові притаманна значна термостабільність і він зберігає 97 % аміноацилюючої активності після інкубації протягом 1 год при температурі 88 ° С Кристали ЛейРСТТ одержано методом дифузії парів із використанням як осаджувана розчину сульфату амонію