Silencing of Hmox1 gene in murine embryonic D3 cells with application of CRIPSR/Cas9 system

Oksygenaza hemowa-1 (HO-1), enzym katalizujący rozpad hemu do żelaza, tlenku węgla i biliwerdyny, reguluję szerokie spektrum różnych procesów, w tym apoptozę, angiogenezę, regenerację mięśnia sercowego oraz różnicowanie pluripotencjalnych komórek macierzystych. Aktywność ta czyni z HO-1 atrakcyjny przedmiot badań, które mogą doprowadzić do stworzenia nowatorskich terapii schorzeń takich jak zawał mięśnia sercowego. W tym celu potrzebne są modelowe linie komórkowe o wyciszonej ekspresji tego enzymu, które pozwolą na dokładny wgląd w regulowane przez niego procesy. Wykorzystanie miejscowo specyficznych nukleaz, takich jak należąca do systemu CRISPR/Cas9 nukleaza Cas9, reprezentuje nowoczesne podejście do edycji genów, dzięki któremu w prosty i dokładny sposób można pozyskiwać linie komórkowe o zmodyfikowanej ekspresji badanych białek. W pracy wykazano, że system CRIPSR/Cas9 może zostać z powodzeniem użyty do wyciszenia kodującego HO-1 genu Hmox1 w genomie mysich zarodkowych komórek macierzystych linii D3.Heme oxygenase (HO-1) is an enzyme catalyzing degradation of heme resulting in generation of iron ions, carbon monooxide and biliverdin. Its activity exhibits broad range of regulating properties in processes such as apoptosis, angiogenesis, regeneration of heart muscle and differentiation of pluripotent stem cells. This activity makes HO-1 an attractive subject of study and its proper characteristic may contribute to designing of novel therapies of illnesses such as myocardial infraction. Cell lines with silenced expression of this enzyme are being obtained in order to acquire insight in processes it regulates. Implementation of site specific nucleases, like Cas9 nuclease complementing CRIPSR/Cas9 system, represents modern approach to gene editing which facilitates simple and precise methods of acquiring of cell lines with modified expression of genes.In this work it was demonstrated, that CRISPR/Cas9 system can be successfully harnessed to silencing of HO-1 gene Hmox1 in D3 murine, embryonic stem cells

Generation of PAX7-GFP hiPSCs line using CRISPR/Cas9 gene editing method

Komórki satelitarne są komórkami macierzystymi odpowiadającymi za regenerację mięśni szkieletowych przez co zaburzenia ich funkcji mogą odgrywać ważną rolę w przebiegu różnych dystrofii mięśniowych, w tym dystrofii mięśniowej Duchenne'a. Niemniej dokładny stopień upośledzenia prawidłowej aktywności komórek satelitarnych oraz jego wpływ na rozwój tych chorób nie jest do końca poznany ze względu na ograniczoną możliwość ich izolacji i namnażania in vitro. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSCs ang. human induced pluripotent stem cells) wraz z wykorzystaniem metody edycji genów CRISPR/Cas9 pozwalają na otrzymywanie dużej liczby różnego typu komórek, kontrolnych oraz z wprowadzoną specyficzną mutacją, dzięki czemu możliwe jest modelowanie chorób oraz badanie procesów związanych z różnicowaniem komórek macierzystych. Jednakże, żeby wykorzystać to podejście w badaniach nad komórkami satelitarnymi, konieczna jest ich identyfikacja oraz wydajna izolacja w trakcie procesu różnicowania. W przypadku obydwu procesów można napotkać problemy spowodowane rzadkim występowaniem tych komórek oraz heterogennością charakteryzujących je markerów powierzchniowych. W związku z tym celem tej pracy było wyprowadzenie i scharakteryzowanie linii hiPSCs o ekspresji białka zielonej fluorescencji (GFP, ang. green fluorescence protein) sprzężonej z ekspresją genu markerowego komórek satelitarnych PAX7. W pierwszym etapie zaprojektowano cząsteczki sgRNA kierujące nukleazę Cas9 na końce ósmego oraz dziewiątego egzonu PAX7, wprowadzono je do plazmidu pSpCas9(BB)-2A-Puro i następnie wykorzystano je do nukleofekcji linii hiPSCs, otrzymanej z wykorzystaniem nieintegrujących wektorów Sendai z jednojądrzastych komórek krwi obwodowej. Po selekcji komórek opornych na puromycynę wyizolowano z nich DNA i przeprowadzono analizę typu Surveyor nuclease assay, która umożliwiła wybranie sekwencji sgRNA gwarantujących wydajne cięcie wybranego regionu PAX7 przez nukleazę Cas9. W kolejnym etapie zaprojektowano i otrzymano metodami klonowania molekularnego konstrukty indukujące naprawę z wykorzystaniem matrycy homologicznej (HDR, ang. homology directed repair) dla obu egzonów. Matrycę odpowiadającą egzonowi 8 oraz odpowiedni plazmid pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA wprowadzono do hiPSCs za pomocą nukleofekcji. Komórki poddano następnie selekcji klonalnej oraz genotypowaniu przy użyciu reakcji łańcuchowej polimerazy aby znaleźć klony o poprawnie wprowadzonej sekwencji GFP, które następnie zróżnicowano do komórek satelitarnych. Nie zaobserwowano specyficznej fluorescencji u zróżnicowanych komórek. Dalsze próby powinny zostać podjęte, w szczególności w celu modyfikacji egzonu 9, jako że izoforma białka PAX7 powstająca z jego udziałem prawdopodobnie pozwoli na uzyskanie zauważalnego poziomu fluorescencji. Cechujące się nim komórki satelitarne znacznie ułatwiłyby badanie regulacji ich różnicowania i roli nieprawidłowości tego procesu w chorobach oraz umożliwiłyby pracę nad terapią komórkową tych chorób.Satellite cells are stem cells responsible for regeneration of skeletal muscles which is why their dysfunction might be related to various dystrophies, such as Duchenne muscular dystrophy. Nevertheless, how and to what extent the impairment of normal function of satellite cells is involved in those maladies is not properly recognized due to hardships with their isolation and in vitro expansion. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) technology combined with CRISPR/Cas9 gene editing method provide a platform for efficient generation of various cell types both control and with introduction of specific mutations to model diseases and to study processes of stem cells differentiation. However, to study satellite cells with this approach, one should be able to identify and efficiently isolate them during differentiation process. This might prove difficult due to their scarcity and the heterogeneity of their surface markers. Hence, the aim of this work was to derive and characterize a hiPSCs line with green fluorescence protein (GFP) expression interlinked with satellite cells' PAX7 marker. At first, gRNA sequences which directed Cas9 nuclease at the ends of PAX7 gene's exons 8 and 9 were designed, introduced into pSpCas9(BB)-2A-Puro plasmid and nucleofected into a hiPSCs line derived with use of non-integrating Sendai vectors from peripheral blood mononuclear cells. After selection of puromycin-resistant cells their DNA was isolated and the surveyor nuclease assay was performed showing which gRNAs allow for efficient cleavage of the selected PAX7 gene region by Cas9 nuclease. In the next part of the experiment homology directed repair (HDR)-inducing constructs were designed and obtained with use of molecular cloning methods for both exons. Afterwards, the construct for exon 8 and corresponding pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA plasmid were nucleofected into hiPSCs. Cells were subjected to clonal selection and genotyped with use of polymerase chain reaction to isolate clones with correct introduction of GFP-coding sequence, which were later differentiated to satellite cells. Differentiated cells exhibited lack of specific fluorescence. However, further attempts should be undertaken, especially with regard to exon 9, since the isoform of PAX7 protein expressed with this exon will probably allow to obtain a noticeable level of fluorescence. Cells exhibiting it would greatly facilitate the research on satellite cells’ differentiation regulation and the role of its dysfunctions in disorders as well as that focused on finding a targeted or cell-based therapy for them

The Initial Factors with Strong Predictive Value in Relation to Six-Month Outcome among Patients Operated due to Extra-Axial Hematomas

Introduction: Traumatic brain injuries (TBI) are a real social problem, with an upward trend worldwide. The most frequent consequence of a traumatic brain injury is extra-axial hemorrhage, i.e., an acute subdural (SDH) and epidural hematoma (EDH). Most of the factors affecting the prognosis have been analyzed on a wide group of traumatic brain injuries. Nonetheless, there are few studies analyzing factors influencing the prognosis regarding patients undergoing surgery due to acute subdural and epidural hematoma. The aim of this study was to identify the factors which have the strongest prognostic value in relation to the 6-month outcome of the patients undergoing surgery for SDH and EDH. Patients and methods: The study included a group of 128 patients with isolated craniocerebral injuries. Twenty eight patients were operated upon due to EDH, and a group of 100 patients were operated upon due to SDH. The following factors from the groups were analyzed: demographic data, physiological factors, laboratory factors, computed tomography scan characteristics, and time between the trauma and the surgery. All of these factors were correlated in a multivariate analysis with the six-month outcome in the Glasgow outcome scale. Results: The factors with the strongest prognostic value are GCS score, respiration rate, saturation, glycaemia and systolic blood pressure. Conclusion: Initial GCS score, respiratory rate, saturation, glycaemia and systolic blood pressure were the factors with the strongest prognostic value