Modulation der Punktspreizfunktion für Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie in Hirnschnitten

Single-molecule localization microscopy (SMLM) is the method of choice to study biological specimens on a nanoscale level. Advantages of SMLM imply its superior specificity due to targeted molecular fluorescence labeling and its enhanced tissue preservation compared to electron microscopy, while reaching similar resolution. To reveal the molecular organization of protein structures in brain tissue, SMLM moves to the forefront: Instead of investigating brain slices with a thickness of a few µm, measurements of intact neuronal assemblies (up to 100 µm in each dimension) are required. As proteins are distributed in the whole brain volume and can move along synapses in all directions, this method is promising in revealing arrangements of neuronal protein markers. However, diffraction-limited imaging still required for the localization of the fluorophores is prevented by sample-induced distortion of emission pattern due to optical aberrations in tissue slices from non-superficial planes. In particular, the sample causes wavefront dephasing, which can be described as a summation of Zernike polynomials. To recover an optimal point spread function (PSF), active shaping can be performed by the use of adaptive optics. The aim of this thesis is to establish a setup using a deformable mirror and a wavefront sensor to actively shape the PSF to correct the wavefront phases in a super-resolution microscope setup. Therefore, fluorescence-labeled proteins expressed in different anatomical regions in brain tissue will be used as experiment specimen. Resolution independent imaging depth in slices reaching tens of micrometers is aimed.Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie ist die Methode der Wahl zur Untersuchung biologische Proben im Bereich von Nanometern. Vorteile von Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie sind vor allem ihre hohe Spezifität von molekularen Farbstoffbindungen sowie die erreichte hohe Auflösung, die vergleichbar ist mit der elektronenmikroskopischen Auflösung, wobei in der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie keine Konservierung der Probe vorgenommen werden muss. Vor allem in der Untersuchung der molekularen Organisation von Proteinstrukturen konnte sich die Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie bewähren. Die Verteilung von Proteinen im gesamten Gehirn, sowie ihre Eigenschaft, sich entlang neuronaler Strukturen zu bewegen, kann mithilfe der Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopie untersucht werden und zu einem besseren Verständnis neuronaler Prozesse beitragen. Proben induzieren optische Aberrationen: Diese Dephasierungen der Wellenfront, welche als Summe von Zernike-Polynomen beschrieben werden kann, verhindert das Erreichen der Auflösungsgrenze. Zur Wiederherstellung einer optimalen Punktspreizfunktion kann die Wellenfront mittels adaptiver Optik aktiv geformt werden. Ziel dieser Arbeit ist der Aufbau eines Einzelmolekül-Lokalisationsmikroskopes mit integrierter adaptiver Optik, bestehend aus einem deformierbaren Spiegel und einem Wellenfrontsensor, um aktiv die Wellenfront zu formen und die Dephasierung zu korrigieren. Zu diesem Zweck werden fluoreszenzmarkierte Proteine, welche in verschiedenen Hirnregionen exprimiert werden, als Proben herangezogen. Optimalerweise könnte so in verschiedenen Tiefen eine ähnliche Auflösung wie bei einer oberflächlichen Messung erreicht werden. Um die Möglichkeiten des Setups zu evaluieren, welches im Verlauf dieser Arbeit aufgebaut wurde, wurden artifizielle Proben erstellt, indem eine Einzelzellschicht hippocampaler Neuronen der Maus, in welchen α-tubulin mit Alexa Fluor 647 angefärbt ist, auf einem 100 µm Maushirnschnitt plaziert wurden. Da letzterer ein hochgradig diffuses Medium zwischen dem Objektiv und den Fluorophoren darstellt, induziert es verschiedene optische Aberrationen, vor allem Sphärische Aberration und Astigmatismus. Indem die Wellenfront und die Punktspreizfunktion von 4 µm Fluosphere Beads, welche eine maximale Emission bei 505 nm haben, und 0.1 µm Tetraspeck Beads, welche eine maximale Emission bei 505 nm zeigen, aufgenommen wurde, konnten die Aberrationen von 521 nm zu 116 nm Quadratmittel des Wellenfrontfehlers reduziert werden. Weiterhin konnten mithilfe der adaptiven Optik Bruchpilot-Anhäufungen in einem Hirnschnitt der Honigbiene in den Calyx der Pilzkörper in einer Messtiefe von 80 µm sichtbar gemacht werden, welche im unkorrigierten Bild nicht sichtbar waren, indem das Quadratmittel des Wellenfrontfehlers von 587 nm auf 196 nm reduziert wird. Insgesamt zeigt die Reduktion des Quadratmittels des Wellenfrontfehlers eine erfolgreiche Korrektur an, aber ist weit entfernt von einer Mikroskopiertechnik, die eine gewinnbringende Forschung in lebenswissenschaftlichen Bereichen garantiert

Hinweise aus der Fehleranalyse eines Mikroskops mit direkter stochastischer optischer Rekonstruktion und sensorgestützter adaptiver Optik

One rarely finds practical guidelines for the implementation of complex optical setups. Here, we aim to provide technical details on the decision making of building and revising a custom sensor-based adaptive optics (AO) direct stochastic optical reconstruction microscope (dSTORM) to provide practical assistance in setting up or troubleshooting similar devices. The foundation of this report is an instrument constructed as part of a master's thesis in 2021, which was built for deep tissue imaging. The setup is presented in the following way: (1) An optical and mechanical overview of the system at the beginning of this internship is given. (2) The optical components are described in detail in the order at which the light passes through, highlighting their working principle and implementation in the system. The optical component include (2A) a focus on even sample illumination, (2B) restoring telecentricity when working with commercial microscope bodies, (2C) the AO elements, namely the deformable mirror (DM) and the wavefront sensor, and their integration, and (2D) the separation of wavefront and image capture using fluorescent beads and a dichroic mirror. After addressing the limitations of the existing setup, modification options are derived. The modifications include the implementation of adjustment only light paths to improve system stability and revise the degrees of freedom of the components and changes in lens choices to meet the specifications of the AO components. Last, the capabilities of the modified setup are presented and discussed: (1) First, we enable epifluorescence imaging of bead samples through 180 µm unstained murine hippocampal tissue with wavefront error correction of ~ 90 %. Point spread function, wavefront shape and Zernike decomposition of bead samples are presented. (2) Second, we move from epifluorescent to dSTORM imaging of tubulin stained primary mouse hippocampal cells, which are imaged through up to 180 µm of unstained murine hippocampal tissue. We show that full width at half maximum (FWHM) of prominent features can be reduced in size by nearly a magnitude from uncorrected epiflourescence images to dSTORM images corrected by the adaptive optics. We present dSTORM localization count and FWHM of prominent features as as a function of imaging depth.Praktische Leitlinien für die Implementierung komplexer optischer Systeme sind selten zu finden. Hier wollen wir technische Details zur Entscheidungsfindung beim Bau und der Überarbeitung eines maßgefertigten Mikroskops mit sensorgestützter adaptiver Optik (AO) und direkter stochastischer optischer Rekonstruktion (dSTORM) bereitstellen, um praktische Hilfestellung bei der Einrichtung oder Fehlerbehebung ähnlicher Geräte zu geben. Grundlage dieses Berichts ist ein Instrument, das im Rahmen einer Masterarbeit im Jahr 2021 für die Abbildung von tiefem Gewebe gebaut wurde. Der Aufbau wird wie folgt dargestellt: (1) Es wird ein optischer und mechanischer Überblick über das System zu Beginn dieses Praktikums gegeben. (2) Die optischen Komponenten werden in der Reihenfolge, in der das Licht sie durchläuft, detailliert beschrieben und ihre Funktionsweise und Umsetzung im System hervorgehoben. Zu den optischen Komponenten gehören (2A) ein Fokus auf gleichmäßige Probenausleuchtung, (2B) die Wiederherstellung der Telezentrizität bei der Arbeit mit handelsüblichen Mikroskopkörpern, (2C) die AO-Elemente, nämlich der deformierbare Spiegel (DM) und der Wellenfrontsensor, und deren Integration, sowie (2D) die Trennung von Wellenfront- und Bilderfassung mittels fluoreszierender Beads und einem dichroitischen Spiegel. Nachdem die Einschränkungen des bestehenden Aufbaus angesprochen wurden, werden Modifikationsmöglichkeiten abgeleitet. Die Modifikationen umfassen die Implementierung von Justage-Lichtpfaden, um die Systemstabilität zu verbessern und die Freiheitsgrade der Komponenten zu überarbeiten, sowie Änderungen bei der Auswahl der Linsen, um die Spezifikationen der AO-Komponenten zu erfüllen. Abschließend werden die Ergebnisse des modifizierten Aufbaus vorgestellt und diskutiert: (1) Zunächst ermöglichen wir die Epifluoreszenz-Abbildung von Bead-Proben durch 180 µm ungefärbtes Hippocampus-Gewebe der Maus mit einer Wellenfront-Fehlerkorrektur von ~ 90 %. Es werden Punktspreizungsfunktion, Wellenfrontform und Zernike-Zerlegung von Bead-Proben vorgestellt. (2) Zweitens gehen wir von der Epifluoreszenz zur dSTORM-Bildgebung von Tubulin-gefärbten primären Hippocampuszellen der Maus über, die durch bis zu 180 µm ungefärbtes Hippocampusgewebe der Maus abgebildet werden. Wir zeigen, dass die Halbwertsbreite (Full Width at Half Maximum, FWHM) auffälliger Merkmale von unkorrigierten Epifloureszenz-Bildern zu dSTORM-Bildern, die durch die adaptive Optik korrigiert wurden, um fast eine Größenordnung reduziert werden kann. Wir präsentieren die Anzahl der dSTORM-Lokalisierungen und die FWHM auffälliger Merkmale als Funktion der Abbildungstiefe

Magnetic Carbon Composite Particles for Dye Adsorption from Water and their Electrochemical Regeneration

Herein, the development of a novel composite particle system prepared from superparamagnetic Fe3O4@SiO2 microparticles as core and coated with a carbon shell is presented. The coating with carbon is done by pyrolyzing furan resin, which was previously deposited on the particle surface by polymerization of furfuryl alcohol. The novel composite material thus combines magnetic and sorptive properties. Upon pyrolysis the magnetic material is converted from magnetite to α‐iron and fayalite, changing its behavior from superparamagnetic to ferromagnetic with nearly zero remanence. The magnetic properties can be utilized to magnetically collect the particles dispersed in fluids, whereas the sorptive properties of the carbon shell can be used to remove organic contaminants from these fluids. The adsorption behavior of the composite particles and a potential electrochemical regeneration route are investigated, using the model dye methylene blue

RF Performance of a Next-Generation L-Band RF Gun at PITZ

A new generation of normal conducting 1.3GHz RF gun was developed to provide a high-quality electron source for superconducting linac driven free-electron lasers like FLASH and European XFEL. Compared to the Gun4 series, Gun5 aims for a 50% increase of the duration of the RF pulse (up to 1 ms at 10 Hz repetition rate) combined with high gradients (up to ~60 MV/m at the cathode). In addition to the improved impedance, the new cavity is equipped with an RF probe to measure and control the amplitude and phase of the RF field inside the gun. The first prototype of the new RF gun was manufactured at DESY and installed at the Photo Injector Test facility at DESY in Zeuthen (PITZ) in October 2021. In mid-October 2021 the RF conditioning began, aiming for achieving the aforementioned RF parameters. The conditioning procedure involves a slow gradual increase in repetition rate, RF pulse duration and peak power while carefully monitoring vacuum conditions and signals from interlock sensors. The results of RF conditioning will be reported