Lokális mechanikai stabilitás és rugalmasság a titin izomfehérjében = Local mechanical stability and elasticity in the muscle protein titin

A pályázat célja az izom passzív rugalmasságáért felelős óriás izomferhérjéből, a titinből kiválasztott molekulaszakaszok mechanikai tulajdonságainak vizsgálata volt. Munkánk során megvizsgáltunk egy csak vázizomban megtalálható, nyolc modul hosszúságú molekulaszakaszt, amelyről kimutattuk, hogy az egyes moduloknak az őket megnyújtó erővel szembeni ellenállása széles tartományban változhat, és nem szisztematikusan kisebb, mint a minden izomtípusban jelenlévő moduloké. Ez arra utal, hogy a titin megnyújtásakor az előbbi szakasz nem tekeredik ki korábban, mint az utóbbi. Tanulmányoztuk a titin egy speciális, ún. PEVK szakaszát, amelyet számos korábbi közleményben ideális polimernek tekintettek, feltételezve, hogy egyes elemei nem hatnak kölcsön egymással. Rövid PEVK szakaszokon végzett vizsgálataink azt mutatták, hogy a ezek a fragmentumok nem tekinthetők ideális polimernek, és hogy alakjukat és rugalmasságukat befolyásolhatják a lánc egyes részei között ható elektrosztatikus kölcsönhatások. Ez alapján lehetséges lehet, hogy az izomban a PEVK környezetében található ionkoncentrációkon keresztül finomhangolható a PEVK szakasz rugalmassága. A titinmolekulákat egyik végükön kipányvázó komplex két moduljáról (Z1 és Z2) kimutattuk, hogy mechanikai stabilitásuk önmagukban alacsonyabb, mint a hasonló, már vizsgált moduloké, a komplex így valószínűleg azáltal válik elég ellenállóvá, hogy abban a Z1 és Z2 modulok és a telethonin fehérje egymást stabilizálják. | The aim of the project was to study the mechanical properties of given molecular segments from the giant muscle protein titin, a molecule responsible for the passive elasticity of muscle. We studied an eight-domain-long segment, present only in skeletal muscle, and showed that the resistance of the individual modules to force is not homogeneous, and it is not systematically lower than that of modules present in all muscle types. This suggests that when titin is stretched, the former modules do not unfold earlier than the latter ones. We explored a special segment of titin, called PEVK, which, in several previous publications, was considered to be an ideal polymer, assuming that the elements of the polymer chain do not interact with each other. Our studies on short PEVK fragments showed that these segments did not behave as ideal polymers, and that their shape and flexibility may be influenced by electrostatic interactions between the chain segments. This raises the possibility that the elasticity of the PEVK region in muscle may be fine-tuned by ion concentrations of the environment. In the case of two modules (Z1 and Z2), components of the complex that anchors one end of titin molecules, we found that their mechanical stability is lower than that of similar, previously studied modules, suggesting that the high stability of the complex is due to the fact that Z1 and Z2 and the protein telethonin stabilize each other

A titin óriás izomfehérje globális szerkezetének és rugalmasságának vizsgálata

9

Dynamic Strength of Titin's Z-Disk End

Titin is a giant filamentous protein traversing the half sarcomere of striated muscle with putative functions as diverse as providing structural template, generating elastic response, and sensing and relaying mechanical information. The Z-disk region of titin, which corresponds to the N-terminal end of the molecule, has been thought to be a hot spot for mechanosensing while also serving as anchorage for its sarcomeric attachment. Understanding the mechanics of titin's Z-disk region, particularly under the effect of binding proteins, is of great interest. Here we briefly review recent findings on the structure, molecular associations, and mechanics of titin's Z-disk region. In addition, we report experimental results on the dynamic strength of titin's Z1Z2 domains measured by nanomechanical manipulation of the chemical dimer of a recombinant protein fragment

Amyloid ß-fibrillumok nanomechanikája = Nanomechanics of amyloid ß-fibrils

Pályázatban amiloid béta (Aß) fibrillumokat, és ehhez kapcsolódóan hasonló természetű amiloid fibrillumokat és egyéb fibrilláris biomolekuláris rendszereket vizsgáltunk. A kísérletekben atomerőmikroszkóp segítségével vizsgáltuk a fibrillumok topográfiai szerkezetét és mechanikai erővezérelt szerkezeti átalakulásait. Különböző amiloid fibrillumok nanomechanikai ujjlenyomatát mértük meg. Felfedeztük, hogy az Aß peptid egy fragmentuma, az Aß25-35, trigonálisan orientált hálózatot hoz létre csillám felszínen. Ez nanotechnológiai alkalmazások lehetőségét veti fel, amellyel kapcsolatban szabadalmi bejelentést indítottunk el. Új mérési technológiákat fejesztettünk ki: térben és időben szinkronizált TIRF/AFM, illetve pásztázó próba kimográfia. A nanomechanikai módszereinket sikerrel adaptáltuk intermedier filamentumokra és miozin vastag filamentumokra. | In this grant proposal we have investigated te properties of amyloid beta (Aß) fibrils and other relevant amyoids and fibrillar biomolecular systems. In our experiments the topographical structure and mechanical force-driven structural changes of the fibrils were explored by using atomic force microscopy(AFM). We measured the nanomechanical fingerprint of various amyloid fibrils. We discovered that a toxic fragment of the full-length Aßpeptide, Aß25-35, forms a trigonally oriented network on mice. The phenomenon opens the possiblity towards nanotechnological applications. Based on this we filed a preliminary patent application (US 61/058,244). We developed novel methodologies: spatially and temporally resolved TIRF/AFM, scanning force kymography. Our nanomechanical methods were implemented on yet unexplored biomolecular systems: intermediate filaments and myosin thick filaments

Lokalna promjenljivost (nestalnost) mehaničkih svojstava tandemskih Ig/segmenata titina

The functionally elastic, I-band part of the myofibrillar protein titin (connectin) contains differentially expressed arrays of serially linked immunoglobulin (Ig)-like domains, the length and composition of which vary among the titin isoforms. The biological rationale of the differential expression as well as the contribution of the Ig domain mechanical characteristics to the overall mechanical behavior of titin are not exactly known. The paper briefly reviews the relevant works that have addressed the Ig-domain mechanics problems and presents the authors’ experimental approach to studying the mechanical behavior of Ig domains. The mechanics of an eight domain segment from the differentially expressed tandem Ig region of titin (I55-62) was studied with an atomic force microscope specially used for stretching single molecules, and the results were compared to known mechanical properties of other domains and segments.Funkcionalno elastična I-vrpca miofibrilarnoga proteina titina (konektina) sadrži razlicito izražene vrste serijski povezanih domena sličnih imunoglobulinu (Ig) čija se duljina i sastav razlikuju u pojedinim titinskim izoformama. Biološki razlozi diferencijalne ekspresije kao i doprinos mehaničkih svojstava domena koje su slične Ig ponašanju titina nisu u cjelosti poznati. U ovom su članku pregledno prikazani dosadašnji relevantni radovi koji se bave problemima mehaničkih svojstava Ig-domena te autorski eksperimentalni pristupi u istraživanju toga problema. U radu su također prikazani rezultati istraživanja mehaničkih svojstava diferencijalno eksprimiranoga tandemskoga Ig-područja titina (155-62), koji se sastoji od osam domena, pomoću mikroskopa atomske snage razlučivanja specijaliziranoga za rastezanje pojedinačne molekule. Ovim postupkom utvrđena mehanička svojstva ispitivanoga dijela titinske molekule uspoređena su s poznatim mehaničkim svojstvima drugih domena i segmenata

Citoszkeletális izomfehérjék molekuláris mechanikája nanobiotechnológiai módszerekkel = Molecular mechanics of cytoskeletal muscle proteins using nanobiotechnological methods

Pályázatunkban elsősorban a titin óriás izomfehérje, annak rekombináns fragmentumai és egyéb izom-citoszkeletális fehérjék nanobiotechnológiai vizsgálatával foglalkoztunk. Egyedi titinmolekulák és rekombináns titin fragmentumok molekuláris mechanikai tulajdonságait és a miozin motorfehérjék in vitro motilitási sajátosságait tanulmányoztuk. Egyedi molekulák mechanikai manipulálására kifejlesztett erőmérő lézercsipesz berendezésünket továbbfejlesztettük, és fluoreszcens technikákkal kombináltuk. Ugyancsak egyedi molekulák mechanikai manipulálására alkalmas atomerőmikroszkópos berendezést helyeztünk üzembe. Atomerőmikroszkópos (AFM) berendezésünket és módszereinket továbbfejlesztettük, mellyel lehetővé vált egyedi fehérjék célzott, in situ mechanikai manipulálása. Az AFM módszert sikerrel kombináltuk teljes belső visszaverődés fluoreszcencia mikroszkópiával (TIRFM), mellyel lehetővé vált sejtek és molekulák egyidejű topográfiai és fluoreszcenciás vizsgálata. Eredeti megfigyeléseket tettünk a titin lokális rugalmasságának és mecahnikai stabilitásának, aktinnal való kölcsönhatásainak és a dezmin intermedier filamentumok nanomechanikai viselkedésének megismerésében. | Our project primarily addressed the nanobiotechnology of the giant muscle protein titin, the recombinant fragments of titin, and other filamentous proteins of the muscle cytoskeleton. We examined the molecular mechanics of individual molecules of titin and its recombinant fragments and the motile characteristics of myosin motor proteins with novel methodologies. Our force-measuring optical tweezers instrument was developed further and was combined with fluorescence imaging. We have installed an atomic force microscope system capable of mechanical manipulation of single biomolecules. We have developed our AFM system and analysis further so that it enables us to carry out in situ force spectroscopic measurements. Our AFM was combined with total internal reflection fluorescence microscopy that enables us to follow the surface topography and mechanics of the sample together with its fluorescence properties, in a spatially and temporally synchronized fashion. We have made and published original observations about the local and global nanomechanical behavior of titin, its interactions with actin filaments, and the elasticity and force-driven transitions of the muscle-specific desmin intermediate filaments

Spatially and Temporally Synchronized Atomic Force and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging and Manipulating Cells and Biomolecules

AbstractThe atomic force microscope is a high-resolution scanning-probe instrument which has become an important tool for cellular and molecular biophysics in recent years but lacks the time resolution and functional specificities offered by fluorescence microscopic techniques. To exploit the advantages of both methods, here we developed a spatially and temporally synchronized total internal reflection fluorescence and atomic force microscope system. The instrument, which we hereby call STIRF-AFM, is a stage-scanning device in which the mechanical and optical axes are coaligned to achieve spatial synchrony. At each point of the scan the sample topography (atomic force microscope) and fluorescence (photon count or intensity) information are simultaneously recorded. The tool was tested and validated on various cellular (monolayer cells in which actin filaments and intermediate filaments were fluorescently labeled) and biomolecular (actin filaments and titin molecules) systems. We demonstrate that with the technique, correlated sample topography and fluorescence images can be recorded, soft biomolecular systems can be mechanically manipulated in a targeted fashion, and the fluorescence of mechanically stretched titin can be followed with high temporal resolution

Citoszkeletális fehérjék szerkezete, dinamikája, mechanikája és kölcsönhatásai: egyedi molekuláktól szupramolekuláris rendszerekig = Structure, dynamics, mechanics and interactions of cytoskeletal proteins: from single molecules to supramolecular systems

Pályázatunkban a citoszkeletális fehérjék szerkezetét, dinamikáját, mechanikáját és kölcsönhatásait vizsgáltuk elsősorban a harántcsíkolt izom különböző molekuláris rendszerein. Szintetikus miozin vastag filamentumok szerkezetét és nanomechanikáját atomerőmikroszkóppal (AFM) mértük. A titin Z-lemez horgonyzó komplex mechanikai stabilitását erőspektroszkópiával vizsgáltuk. Natív vázizom titin rugalmasságának és erővezérelt szerkezetváltozásainak vizsgálatára erővisszacsatolt lézercsipeszt fejlesztettünk. A titin PEVK domén konformációs dinamikáját FRET spektroszkópiával vizsgáltuk. A dezmin intermedier filamentumok és protofibrillumok szerkezetét és nanomechanikáját ugyancsak AFM-mel mértük meg. A szívizom típusú miozin-kötő C-fehérje molekuláris mechanikáját Monte-Carlo módszerrel szimuláltuk. Az aktomiozin motilitás pontosabb térbeli változásainak mérésére fluoreszcencia interferencia kontraszt (FLIC) mikroszkópia fejlesztését kezdtük meg. Az izommechanika organizmusban való mérésére speciális, AFM-alapú módszert dolgoztunk ki C. elegans rendszeren. A pályázat közvetlen támogatásával nyolc eredeti közlemény és egy könyvfejezet került publikálásra. | In our project we investigated the structure, dynamics, mechanics and interactions of cytoskeletal proteins mainly on muscle-derived molecular systems. The structure and nanomechanics of myosin thick filaments were explored by using atomic force microscopy (AFM). The mechanical stability of the Z-disc titin-anchoring complex was measured with single-molecule force spectroscopy. In order to measure the elasticity and force-driven structural changes in native titin molecules with high resolution, we developed a fast force-clamp optical tweezers apparatus. The structural dynamics of titin PEVK domain fragments was measured by using FRET spectroscopy. The structure and nanomechanical behavior of desmin intermediate filaments and protofibrils were also measured with AFM. For the simulation of the force versus extension of cardiac myosin-binding protein-C we used Monte-Carlo methods. To reveal greater spatial detail in the in vitro actomyosin motility we began developing a fluorescence interference contrast (FLIC) microscope system. In order to investigate the actomyosin mechanics within an organism, we developed a novel, AFM-based detection method based on C. elegans. With the direct support of the grant eight original papers and one book chapter were published