Mononucleotide repeats are asymmetrically distributed in fungal genes

ABSTRACT: BACKGROUND: Systematic analyses of sequence features have resulted in a better characterisation of the organisation of the genome. A previous study in prokaryotes on the distribution of sequence repeats, which are notoriously variable and can disrupt the reading frame in genes, showed that these motifs are skewed towards gene termini, specifically the 5' end of genes. For eukaryotes no such intragenic analysis has been performed, though this could indicate the pervasiveness of this distribution bias, thereby helping to expose the selective pressures causing it. RESULTS: In fungal gene repertoires we find a similar 5' bias of intragenic mononucleotide repeats, most notably for Candida spp., whereas e.g. Coccidioides spp. display no such bias. With increasing repeat length, ever larger discrepancies are observed in genome repertoire fractions containing such repeats, with up to an 80-fold difference in gene fractions at repeat lengths of 10 bp and longer. This species-specific difference in gene fractions containing large repeats could be attributed to variations in intragenic repeat tolerance. Furthermore, long transcripts experience an even more prominent bias towards the gene termini, with possibly a more adaptive role for repeat-containing short transcripts. CONCLUSIONS: Mononucleotide repeats are intragenically biased in numerous fungal genomes, similar to earlier studies on prokaryotes, indicative of a similar selective pressure in gene organization

Efficient cloning system for construction of gene silencing vectors in Aspergillus niger

An approach based on Gateway recombination technology to efficiently construct silencing vectors was developed for use in the biotechnologically important fungus Aspergillus niger. The transcription activator of xylanolytic and cellulolytic genes XlnR of A. niger was chosen as target for gene silencing. Silencing was based on the expression vector pXLNRir that was constructed and used in co-transformation. From all the strains isolated (N = 77), nine showed poor xylan-degrading activities in two semi-quantitative plate assays testing different activities for xylan degradation. Upon induction on D-xylose, transcript levels of xlnR were decreased in the xlnR-silenced strains, compared to a wild-type background. Under these conditions, the transcript levels of xyrA and xynB (two genes regulated by XlnR) were also decreased for these xlnR-silenced strains. These results indicate that the newly developed system for rapid generation of silencing vectors is an effective tool for A. niger, and this can be used to generate strains with a tailored spectrum of enzyme activities or product formation by silencing specific genes encoding, e.g., regulators such as Xln

Shotgun proteomics of Aspergillus niger microsomes upon D-xylose induction

Protein secretion plays an eminent role in cell maintenance and adaptation to the extracellular environment of microorganisms. Although protein secretion is an extremely efficient process in filamentous fungi, the mechanisms underlying protein secretion have remained largely uncharacterized in these organisms. In this study, we analyzed the effects of the d-xylose induction of cellulase and hemicellulase enzyme secretion on the protein composition of secretory organelles in Aspergillus niger. We aimed to systematically identify the components involved in the secretion of these enzymes via mass spectrometry of enriched subcellular microsomal fractions. Under each condition, fractions enriched for secretory organelles were processed for tandem mass spectrometry, resulting in the identification of peptides that originate from 1,081 proteins, 254 of which-many of them hypothetical proteins-were predicted to play direct roles in the secretory pathway. d-Xylose induction led to an increase in specific small GTPases known to be associated with polarized growth, exocytosis, and endocytosis. Moreover, the endoplasmic-reticulum-associated degradation (ERAD) components Cdc48 and all 14 of the 20S proteasomal subunits were recruited to the secretory organelles. In conclusion, induction of extracellular enzymes results in specific changes in the secretory subproteome of A. niger, and the most prominent change found in this study was the recruitment of the 20S proteasomal subunits to the secretory organelle

Microarray Analysis of Late Response to Boron Toxicity in Barley (Hordeum vulgare L.) Leaves

DNA microarrays, being high-density and high-throughput, allow quantitative analyses of thousands of genes and their expression patterns in parallel. In this study, Barley1 GereChip was used to investigate transcriptome changes associated with boron (B) toxicity in a sensitive barley cultivar (Hordeum vulgare L. cv. Hamidye). Eight-day-old aseptically grown seedlings were subjected to 5 or 10 mM boric acid (B(OH)(3)) treatments for 5 days and expression profiles were determined with DNA microarrays using total RNA from leaf tissues. Among the 22,840 transcripts - each represented with a probe set on the GeneChip - 19,424 probe sets showed intensity values greater than 20(th) percentile in at least one of the hybridizations. Compared to control (10 mu M B(OH)(3)), 5 mM B(OH)(3) treatment resulted in differential expression of 168 genes at least by twofold. Moreover, 10 mM B(OH)(3) treatment resulted in at least twofold induction or reduction in expression of 312 transcripts. Among these genes, 37 and 61 exhibited significantly (P <0.05) altered levels of expression under 5 and 10 mM B(OH)(3) treatments, respectively. Differentially expressed genes were characterized using expression-based clustering and HarvEST:Barley. Investigations of expression profiles revealed that B toxicity results in global changes in the barley transcriptome and networks of signaling or molecular responses. A noticeable feature of response to 8 was that it is highly interconnected with responses to various environmental stresses. Additionally, induction of jasmonic acid related genes was found to be an important late response to B toxicity. Determination of responsive genes will shed light on successive studies aiming to elucidate molecular mechanism of B toxicity or tolerance. To the best of our knowledge, this is the first report on global expression analysis of barley seedlings under B toxicity

D-Xylose Concentration-Dependent Hydrolase Expression Profiles and the Function of CreA and XlnR in Aspergillus niger

Aspergillus niger is an important organism for the production of industrial enzymes such as hemicellulases and pectinases. The xylan-backbone monomer, d-xylose, is an inducing substance for the coordinate expression of a large number of polysaccharide-degrading enzymes. In this study, the responses of 22 genes to low (1 mM) and high (50 mM) d-xylose concentrations were investigated. These 22 genes encode enzymes that function as xylan backbone-degrading enzymes, accessory enzymes, cellulose-degrading enzymes, or enzymes involved in the pentose catabolic pathway in A. niger. Notably, genes encoding enzymes that have a similar function (e.g., xylan backbone degradation) respond in a similar manner to different concentrations of d-xylose. Although low d-xylose concentrations provoke the greatest change in transcript levels, in particular, for hemicellulase-encoding genes, transcript formation in the presence of high concentrations of d-xylose was also observed. Interestingly, a high d-xylose concentration is favorable for certain groups of genes. Furthermore, the repressing influence of CreA on the transcription and transcript levels of a subset of these genes was observed regardless of whether a low or high concentration of d-xylose was used. Interestingly, the decrease in transcript levels of certain genes on high d-xylose concentrations is not reflected by the transcript level of their activator, XlnR. Regardless of the d-xylose concentration applied and whether CreA was functional, xlnR was constitutively expressed at a low leve

The structure and expression of the pyruvatekinase gene of Aspergillus nidulans and Aspergillus niger

Dit proefschrift "Het pyruvaat kinase gen en zijn expressie in Aspergillus nidulans en Aspergillus niger " beschrijft het onderzoek naar de structuur en expressie van het pyruvaat kinase gen in deze schimmels.De doelstelling van dit onderzoek was de opheldering van de genstructuur van het pyruvaat kinase gen, vergelijking met de genstructuur van het overeenkomstige gen uit andere organismen, en de studie naar de expressie van het genproduct, pyruvaat kinase.De pyruvaat kinase genen van A.nidulans en A.niger zijn geisoleerd met behulp van heterologe hybridizatie, waarbij het sterk overeenkomstige pyruvaat kinase gen uit gist gebruikt is om beide genen op te sporen. De identiteit en functionaliteit van het pyruvaat kinase gen uit A.nidulans is onderzocht door een transformatie systeem te ontwikkelen, gebaseerd op een pyruvaat kinase mutant. Deze mutanten kunnen niet groeien op media met een glycolytische koolstofbron, zoals glucose of sucrose. Als gevolg hiervan kunnen transformanten, die een functioneel gen in hun genoom geïntegreerd hebben, op deze media geselecteerd kunnen worden.Het A.nidulans pyruvaat kinase gen is gelocaliseerd op een 2,9 kb EcoRI/ Bam HI fragment. Transformatie van A.nidulans WG231, met een zodanige mutatie in het pyruvaat kinase gen, dat geen pyruvaat kinase eiwit meer gevormd wordt, leidt tot volledig herstel van de pyruvaat kinase activiteit. Er wordt een rechtstreeks verband gevonden tussen het aantal kopiëen van dit fragment dat in het genoom geïntegreerd is, en de gemeten pyruvaat kinase activiteit. Hieruit wordt geconcludeerd dat het genoemde fragment het gehele gen bevat, inclusief de gebieden op het DNA die betrokken zijn bij de expressie. Hoewel het gen gereguleerd wordt afhankelijk van aangeboden koolstofbron, zijn er aanwijzingen gevonden dat er regulerende DNA sequenties ontbreken in dit 2,9 kb EcoRI/ Bam HI fragment. Uit de gevonden waarden van de pyruvaat kinase activiteit na groei op een gluconeogenetische koolstofbron als acetaat, welke in de transformanten verhoogd is ten op zichte van die in de wild type stam, wordt geconcludeerd dat de gen activiteit gereguleerd wordt door repressie van de expressie.Na transformatie wordt het transformerende DNA in ongeveer 90% van de gevallen geïntegreerd aangetroffen op de plaats van het pyruvaat kinase gen binnen het genoom. Slechts bij uitzondering vindt integratie op een andere, willekeurige plaats in het genoom plaats. Dit komt overeen met de resultaten, zoals die door andere onderzoekers gevonden worden, namelijk dat hoofdzakelijk homologe integratie plaats vindt daar waar rechtstreeks op de betreffende genetische eigenschap geselecteerd wordt. De hier omschreven resultaten en conclusies, worden beschreven in hoofdstuk 2.Het pyruvaat kinase eiwit uit A.nidulans is geïsoleerd uit de wild type stam, en uit een transformant met een verhoogde expressie, ten gevolge van een hoger aantal copiën van het pyruvaat kinase gen. Dit eiwit is gedeeltelijk gekarakteriseerd, en beschreven in hoofdstuk 3. Karakteristieken van het eiwit, zoals het molekuulgewicht en de aminozuursamenstelling, zijn vergeleken met waarden welke zijn afgeleid zijn uit de basenvolgorde in het coderende gebied van het gen. Voor deze karakteristieken is een goede overeenkomst gevonden (hoofdstuk 4). Het gen codeert voor een eiwit bestaande uit 526 aminozuren, dat sterke homologie vertoont met pyruvaatkinase uit gist en zoogdieren.De coderende sequentie van het pyruvaat kinase gen, wordt onderbroken door zeven intronen. Deze worden niet gelijkmatig verdeeld binnen de coderende sequentie gevonden, maar voornamelijk aan het begin van het gen, het S' uiteinde. De positie van deze intronen, is vergeleken met de positie van de intronen in de pyruvaat kinase genen afkomstig uit onder andere kip, en rat. Uit deze vergelijking blijkt dat drie van de zeven intronen in het A.nidulans gen, in dezelfde, of in een vrijwel gelijke positie gevonden wordt. Het aantal en de lengte van de intronen in het pyruvaat kinase gen van A.nidulans reflecteert de intermediaire positie welke Aspergilli in de evolutie innemen, tussen lagere eukaryoten zoals gist enerzijds en de hogere eukaryoten, zoals kat, kip en rat anderzijds.Het pyruvaat kinase gen van A.niger is op soortgelijke wijze geisoleerd als dat van A.nidulans (hoofdstuk 5). De functionaliteit van dit gen is aangetoond door middel van co-transformatie, waarbij het pyrA gen uit A.niger gebruikt is als selectie marker. In de gevonden transformanten werden verhoogde expressie niveau's gevonden, tot het dertigvoudige van het wild type niveau. In alle gevallen blijkt het pyruvaat kinase gen in dit geval op een willekeurige plaats in het genoom geintegreerd te zijn, mogelijk als gevolg van de gekozen experimentele condities.Evenals het A.nidulans gen wordt het A.niger gen onderbroken door zeven intronen, die weliswaar verschillen in lengte van die in A.nidulans maar zich op identieke posities in het gen bevinden. Beide Aspergillus genen vertonen zeer veel overeenkomst; ongeveer 90% van zowel de basen volgorde als de aminozuur volgorde is identiek, terwijl ook het totaal aantal aminozuren gelijk is, namelijk 526.In hoofdstuk 6 wordt de ruimtelijke structuur van het pyruvaat kinase gen uit Aspergillus beschreven. Deze ruimtelijke structuur is afgeleid uit de structuur van het kattespier pyruvaat kinase. De vergelijking van belde structuren toont verschillen aan m.b.t. de fructose 1,6-bifosfaat bindingsplaats en op het niveau van subeenheid interacties. Met dit laatste is een mogelijke correlatie vastgelegd tussen allosteer en niet allosteer gereguleerde pyruvaat kinase vormen. Op grond van de ruimtelijke structuur wordt verder gepostuleerd dat fosforylering van het pyruvaat kinase uit Aspergillus onwaarschijnlijk is

Proteomics of industrial fungi: trends and insights for biotechnology

Filamentous fungi are widely known for their industrial applications, namely, the production of food-processing enzymes and metabolites such as antibiotics and organic acids. In the past decade, the full genome sequencing of filamentous fungi increased the potential to predict encoded proteins enormously, namely, hydrolytic enzymes or proteins involved in the biosynthesis of metabolites of interest. The integration of genome sequence information with possible phenotypes requires, however, the knowledge of all the proteins in the cell in a system-wise manner, given by proteomics. This review summarises the progress of proteomics and its importance for the study of biotechnological processes in filamentous fungi. A major step forward in proteomics was to couple protein separation with high-resolution mass spectrometry, allowing accurate protein quantification. Despite the fact that most fungal proteomic studies have been focused on proteins from mycelial extracts, many proteins are related to processes which are compartmentalised in the fungal cell, e.g. ß-lactam antibiotic production in the microbody. For the study of such processes, a targeted approach is required, e.g. by organelle proteomics. Typical workflows for sample preparation in fungal organelle proteomics are discussed, including homogenisation and sub-cellular fractionation. Finally, examples are presented of fungal organelle proteomic studies, which have enlarged the knowledge on areas of interest to biotechnology, such as protein secretion, energy production or antibiotic biosynthesi

Purification and characterization of an -L-rhamnosidase from Aspergillus niger.

An enzyme with -l-rhamnosidase activity was purified by anion exchange chromatography from an Aspergillus niger commercial preparation. The -l-rhamnosidase was shown to be N-glycosylated, and had a molecular mass of 85 kD on sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis of which approximately 12% was contributed by carbohydrate. The enzyme was optimally active at pH 4.5 and 65°C. When tested towards p-nitrophenyl--l-rhamnopyranoside it showed Km and Vmax values of 2.9 mM and 20.6 U mg−1, respectively whereas it was inhibited competitively by l-rhamnose (Ki 3.5 mM). Substrate specificity studies showed -l-rhamnosidase to be active both on -1,2 and -1,6 linkages to β-d-glucose. Moreover, the enzyme was able to release l-rhamnose from geranyl-β-d-rutinoside and 2-phenylethyl-β-d-rutinoside