Funktionelle Analyse des P-Klasse pentatricopeptide repeat Proteins DWEORG1 in Bezug auf die mitochondriale Translation in Arabidopsis thaliana

Die Regulierung der mitochondrialen Genexpression erfolgt durch im Zellkern codierte Proteine. Viele dieser Proteine gehören zur Familie der pentatricopeptide repeat (PPR) Proteine, eine der größten Proteinfamilien in Landpflanzen, mit versatilen Funktionen in der Transkription, RNA-Stabilisierung/-Degradierung, Edierung, Bildung von 5‘- und 3‘-Enden, dem Spleißen und der Translation mitochondrialer und plastidärer Transkripte (Lurin et al. 2004; Barkan und Small 2014). Der Prozess der mitochondrialen Translation in Pflanzen ist bisher kaum verstanden und Gegenstand aktueller Forschung. Die wenigen bisher identifizierten Faktoren, die die Translation in pflanzlichen Mitochondrien beeinflussen, gehören vor allem zu den PPR-Proteinen (Manavski et al. 2012; Haili et al. 2016; Waltz et al.2020a). Zudem wurden einige PPR-Proteine als Teil des pflanzlichen mitochondrialen Ribosoms (Mitoribosom) beschrieben (Waltz et al. 2019; Rugen et al. 2019) (im weiteren als rPPR-Proteine bezeichnet). Im Vorfeld dieser Arbeit wurde ein weiteres PPR-Protein –DWEORG1 – charakterisiert, für das eine Funktion in der Translation des cox2 Transkripts festgestellt wurde (Bruhs 2012). Im Rahmen dieser Arbeit sollte sowohl die heterologe Überexpression DWEORG1s in E. coli etabliert werden als auch eine Funktionsanalyse hinsichtlich der mitochondrialen Translation durchgeführt werden. Die heterologe Überexpression der PPR-Proteine in E. coli gestaltet sich allgemein als sehr schwierig (Andrés-Colás und Van Der Straeten 2017). Hier wurde ein System mit dem SUMO3-tag etabliert und erfolgreich für die Synthese DWEORG1s in E. coli verwendet. Aufgrund der vorangegangenen Ergebnisse in Bruhs (2012) wurde zunächst eine transkriptspezifische Funktion DWEORG1s angenommen. Sodass der Fokus anfangs auf das cox2 Transkript gelegt wurde. Die Untersuchung des Spleißens und der Bildung der 5‘- und 3‘-Enden des Transkripts ergaben, dass diese Prozesse in dweorg1 Pflanzen nicht beeinträchtigt sind. Ein sekundärer Effekt auf die Translation durch diese Prozesse wurde demnach ausgeschlossen. Analysen der mitochondrialen Translationseffizienz in dweorg1 durch ein ribosome profiling ergaben, dass die Translationseffizienz aller mitochondrialer Transkripte negativ beeinträchtigt ist. Am stärksten sind hierbei die Transkripte cox2, rps4, rpl5 und ccmFN2 betroffen. Die nähere Charakterisierung DWEORG1s zeigte, dass es sich um ein noch nicht beschriebenes rPPR-Protein handelt und somit einen Teil des Mitoribosoms bildet. Dies wurde sowohl über Saccharose-Gradienten- als auch Co-Immunpräzipitations-Analysen bestätigt. Das Sedimentationsverhalten der mitoribosomalen Proteine RPS4 und RPL16 aus dweorg1 in einem Saccharose-Gradienten ließ darauf schließen, dass die Mitoribosomen in dweorg1 destabilisiert sind. Dies wurde über die Analyse des rRNA-Niveaus durch eine quantitative RT-PCR bestätigt. Vermutlich bindet DWEORG1 ebenso an rRNA-Erweiterungssegmente wie die bisher beschriebenen rPPR-Proteine. Dies würde erklären, warum die RNA-Bindung DWEORG1s an ein cox2 RNA-Fragment nicht nachgewiesen wurde. Zudem lassen die Ergebnisse dieser Arbeit eine Beteiligung DWEORG1s an der Salz-Stress-Antwort in A. thaliana vermuten. Der molekulare Mechanismus, der dem zugrunde liegt, konnte jedoch nicht näher bestimmt werden. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine allgemeine Funktion DWEORG1s in der mitochondrialen Translation als Teil des Mitoribosoms nachgewiesen. Dabei wird eine Rolle DWEORG1s als Stabilitätsfaktor der mitochondrialen rRNA bzw. Mitoribosomen vermutet. Zudem ist eine zusätzliche Funktion DWEORG1s in der Regulierung der Salz-Stress-Antwort in A. thaliana nicht auszuschließen

Untersuchung eines mitochondrialen Proteins führt zu neuen Erkenntnissen über die Proteinbiosynthese in pflanzlichen Mitochondrien

Der Beitrag stellt aktuelle Forschungsergebnisse der Abteilung ›Botanische Genetik und Molekularbiologie‹ der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel vor, die bei der Untersuchung molekularer Prozesse innerhalb der pflanzlichen Mitochondrien des Modellorganismus Arabidopsis thaliana gewonnen wurden. Sie legen nahe, dass Ribosomen in den Mitochondrien eine variable Zusammensetzung haben und die Genexpression unter verschiedenen Bedingungen steuern.This article presents recent research results from the Department of ›Botanical Genetics and Molecular Biology‹ at Kiel University, which were obtained by studying molecular processes within the plant mitochondria of the model organism Arabidopsis thaliana. They suggest that ribosomes in mitochondria have variable composition and control gene expression under different conditions

The P-type pentatricopeptide repeat protein DWEORG1 is a non-previously reported rPPR protein of Arabidopsis mitochondria

Gene expression in plant mitochondria is mainly regulated by nuclear-encoded proteins on a post-transcriptional level. Pentatricopeptide repeat (PPR) proteins play a major role by participating in mRNA stability, splicing, RNA editing, and translation initiation. PPR proteins were also shown to be part of the mitochondrial ribosome (rPPR proteins), which may act as regulators of gene expression in plants. In this study, we focus on a mitochondrial-located P-type PPR protein-DWEORG1-from Arabidopsis thaliana. Its abundance in mitochondria is high, and it has a similar expression pattern as rPPR proteins. Mutant dweorg1 plants exhibit a slow-growth phenotype. Using ribosome profiling, a decrease in translation efficiency for cox2, rps4, rpl5, and ccmFN2 was observed in dweorg1 mutants, correlating with a reduced accumulation of the Cox2 protein in these plants. In addition, the mitochondrial rRNA levels are significantly reduced in dweorg1 compared with the wild type. DWEORG1 co-migrates with the ribosomal proteins Rps4 and Rpl16 in sucrose gradients, suggesting an association of DWEORG1 with the mitoribosome. Collectively, this data suggests that DWEORG1 encodes a novel rPPR protein that is needed for the translation of cox2, rps4, rpl5, and ccmFN2 and provides a stabilizing function for mitochondrial ribosomes