Acriflavine targets oncogenic STAT5 signaling in myeloid leukemia cells

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Interactions entre récepteur des glucocorticostéroïdes et facteurs de transcription

La régulation de l’expression des gènes par les glucocorticostéroïdes est médiée par un récepteur intracellulaire (GR) permettant la transduction du signal hormonal externe dans le noyau. De nombreuses études in vitro et plus récemment in vivo ont montré que cette régulation se fait par deux mécanismes distincts nécessitant soit l’interaction directe du complexe hormone-récepteur avec des éléments de réponse spécifiques présents dans les régions régulatrices de ces gènes et appelés GRE (Glucocorticoid Response Elements) ou indirectement par le biais d’une interaction protéine-protéine entre le récepteur et d’autres facteurs de transcription. Pour ces deux types de mécanismes, la régulation positive ou négative de l’expression des gènes par les glucocorticostéroides est déterminée par la configuration des régions régulatrices, de leur structure chromatinienne et des protéines composant les complexes transcriptionnels impliquées dans l’interaction avec le GR

Oxidative metabolism in cancer

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Propriétés oncogéniques des facteurs de transcription STAT5

Les études chez la souris ont montré que les facteurs de transcription STAT5 sont nécessaires à la prolifération et /ou à la survie des cellules hématopoïétiques. Ces protéines jouent un rôle important dans les propriétés transformantes de certaines oncoprotéines telles que Bcr-Abl, Tel-Abl et Tel-Jak2 et sont souvent constitutivement activées dans les cellules de tumeurs solides ou de patients leucémiques. Leur implication directe dans la genèse de leucémie a été démontrée par l utilisation de formes mutées constitutivement actives de STAT5 (cS5F et STAT51*6). Afin de comprendre les mécanismes moléculaires mis en jeu dans l activité oncogénique de STAT5, nous avons étudié les propriétés transformantes de cS5F dans les cellules primaires de moelle osseuse de souris ainsi que dans la lignée cellulaire Ba/F3. L expression de cS5F dans les cellules de moelle osseuse de souris conduit, en effet, à l induction d une leucémie multi-linéage après transplantation de ces cellules dans des souris receveuses et rend les cellules Ba/F3 indépendantes de l IL-3 pour leur prolifération. Nos résultats montrent aussi bien dans les cellules primaires leucémiques que dans les cellules Ba/F3 que cS5F induit l activation d Akt un effecteur crucial de la voie PI 3-kinase. Cette activation passe par une interaction entre la sous-unité régulatrice de la PI 3-kinase, p85 et la molécule adaptatrice Gab2. L utilisation de formes mutées de Gab2 ou d Akt et d un inhibiteur pharmacologique de la PI 3-kinase montre que l activation de la voie Gab2/PI 3-kinase/Akt joue probablement un rôle essentiel dans les propriétés leucémogènes de cS5F. Les résultats des études immuno-cytochimiques et de Western blot sur des extraits nucléaires et cytoplasmiques avec un anticorps anti-P-Y-Stat5 montrent que cS5F est majoritairement localisé dans le cytoplasme des cellules leucémiques, soutenant donc nos observations d un rôle actif de cette protéine oncogénique dans ce compartiment cellulaire. Des résultats similaires ont été obtenus sur des cellules et de biopsies médullaires de patients leucémiques (LMC, LAM et mastocytoses), montrant ainsi que cette localisation inhabituelle des formes actives de STAT5 n est pas liée à une propriété spécifique de cS5F. La présence de formes phosphorylées de STAT5 dans les mastocytoses nous a conduit à étudier le rôle de STAT5 dans la signalisation de c-Kit, le récepteur au Stem Cell Factor (SCF). Nos résultats montrent que l activation de STAT5, aussi bien dans les cellules de moelle osseuse transformées par cS5F que dans des progéniteurs hématopoïétique humains, joue un rôle important le développement des mastocytes in vitro en présence de SCF et que son activation constitutive contribue à un développement anormal des mastocytes in vivo. L ensemble de nos données suggère que l activation constitutive de STAT5 pourrait promouvoir une localisation et une activité cytoplasmique susceptible d être relié à l activation d autres voies de signalisation comme la voie PI3-K et que l inhibition simultanée de l activité de STAT5 (cytoplasmique et nucléaire) et de la PI 3-kinase pourrait ouvrir des perspectives thérapeutiques intéressantes dans le traitement d hémopathies associées à l activation de ces deux voies de signalisation.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Régulation de l'activité des facteurs de transcription Stat5a et Stat5b dans les cellules hématopoïétiques

Les protéines Stat5a/b jouent un rôle important dans la quiescence, l auto-renouvellement et l expansion des cellules souches hématopoïétiques (CSH) normales et leucémiques. Dans ce projet, nous avons analysé le degré d implication des protéines Stat5a et Stat5b dans l expansion des CSH/progéniteurs hématopoïétiques humains CD34+ induite par des facteurs de croissance de l hématopoïèse précoce, le SCF et le Flt3-L via l utilisation de protéines recombinantes transductibles TAT-Stat5a et TAT-Stat5b. Nos résultats montrent que la protéine TAT-Stat5a induit spécifiquement l expansion des progéniteurs hématopoïétiques en réponse au SCF. Cet effet est principalement lié à la présence d un résidu Sérine localisé à la position 779 dans le domaine de transactivation de Stat5a et absent dans celui de Stat5b. Ce résidu est phosphorylé constitutivement dans les cellules CD34+ et la mutation de ce résidu dans la protéine TAT-Stat5a abolit son effet mitogène. Les kinases impliquées dans cette phosphorylation restent à identifier. Contrairement au SCF, les protéines TAT-Stat5a et TAT-Stat5b induisent de manière équivalente mais modestement l expansion des cellules CD34+ humaines en présence de Flt3-L via des mécanismes distincts. La divergence de séquence et d activité des régions COOH-terminales des protéines Stat5a et Stat5b nous a conduit à identifier des partenaires protéiques interagissant spécifiquement avec ces régions. Par une approche de double- hybride en bactérie, nous avons isolé un nouveau partenaire spécifique de Stat5b : la protéine suppresseur de tumeur hTid1. Nous avons montré que hTid1 régulait négativement l expression et l activité de Stat5b dans les cellules hématopoïétiques et que la région centrale riche en Cystéine de hTid1 était essentielle dans ce processus. Les protéines Stat5a/b étant impliquées dans la transformation cellulaire, nos différentes données ouvrent des perspectives de recherche intéressantes sur l identification de nouvelles molécules pharmacologiques ciblant à la fois la ou les kinases phosphorylant spécifiquement Stat5a ou mimant l interaction hTid1/Stat5b.The Stat5a/b proteins play an important role in quiescence, self-renewal and expansion of normal and leukemic hematopoietic stem cells (HSC). In this project, we analyzed the degree of involvement of Stat5a and Stat5b proteins in the expansion of human HSC/progenitors CD34+ cells induced by the early-acting growth factors, SCF and Flt3-L via the use of transducible TAT-Stat5a and TAT-Stat5b recombinant proteins. Our results show that TAT-Stat5a protein induced specifically the expansion of hematopoietic progenitors in response to SCF. This effect is mainly due to the presence of a Serine residue located at position 779 in the transactivation domain of Stat5a and absent in that of Stat5b. This residue is constitutively phosphorylated in CD34+ cells and the mutation of this residue in the TAT-Stat5a protein abolishes its mitogenic effect. The protein kinases involved in this phosphorylation remain unidentified. Unlike SCF, the TAT-Stat5a and TAT-Stat5b proteins induce equally but modestly expansion of human CD34+ cells in the presence of Flt3-L via distinct mechanisms. The differences in the sequence and function of the COOH-terminal regions of Stat5a and Stat5b proteins lead us to identify protein partners that interact specifically with these regions. By a bacterial two-hybrid approach, we isolated a new specific partner of Stat5b: the tumor suppressor protein hTid1. We have shown that hTid1 negatively regulates the expression and activity of Stat5b in hematopoietic cells via its central Cystein rich region. The Stat5a/b proteins being involved in cell transformation, our various data provide opportunities for interesting researchs on the identification of new drug molecules targeting the kinases that phosphorylate specifically Stat5a or mimicking the hTid1/Stat5b interaction.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

Signalisation via STAT5 et les oncoprotéines TEL/ABL et TEL/JAK2 (étude des propriétés transformantes)

L'utilisation de formes mutées constitutivement actives de STAT5 a montré le rôle direct de ces facteurs de transcription dans la genèse de leucémies. STAT5 est également une cible commune d'oncogènes cellulaires à activité tyrosine kinase qui ont été caractérisés dans différentes hémopathies malignes humaines. Nous nous sommes dans un premier temps intéressés aux propriétés oncogéniques de STAT5 et en particulier à son interaction avec la voie de signalisation PI 3-Kinase/Akt. Nos résultats montrent que STAT5 interagit avec la PI 3-Kinase via la protéine adaptatrice Gab2 dans une lignée de cellules hématopoïétiques, les cellules Ba/F3 et dans des cellules primaires de moelle osseuse de souris, toutes deux transformées par des formes mutées constitutivement actives de STAT5. La signification fonctionnelle de cette interaction a été analysée par l'introduction d'une forme mutée de Gab2 incapable d'interagir avec la PI 3-Kinase dans les deux types cellulaires. Les résultats de cette étude montrent que l'expression d'un tel mutant inhibe la prolifération des cellules et l'activation d'Akt et des MAP Kinases ERK1/ERK2 induite par ces formes oncogéniques de STAT5. Ces données indiquent que l'activité transformante voire leucémogène de ces formes actives passent en partie par l'activation des voies PI 3-Kinase/Akt et Ras/MAP Kinases et soulignent un rôle tout à fait inattendu et possiblement relié à l'activation oncogénique de STAT5 en tant qu'effecteur de la signalisation. Nous nous sommes également intéressés aux modalités d'activation de différentes voies de signalisation (STAT5, PI 3-K/Akt et Ras/MAPK) par les protéines de fusion oncogéniques TEL/ABL et TEL/JAK2 et nous avons montré que les protéines kinases de la famille Src sont des médiateurs importants de la signalisation induite par TEL/ABL mais ne sont pas requise pour la transformation induite par TEL/JAK2. Nous avons également identifié et montré qu'un des membres de la famille Src, la protéine tyrosine kinase Hck est nécessaire aux propriétés transformantes de la protéine de fusion TEL/ABL.AMIENS-BU Santé (800212102) / SudocSudocFranceF

ETUDE DU ROLE DES FACTEURS DE TRANSCRIPTION STAT5A ET STAT5B DANS LA SURVIE DES CELLULES HEMATOPOIETIQUES

PARIS7-Bibliothèque centrale (751132105) / SudocSudocFranceF

Prolactin-mediated gene activation in mammary epithelial cells

International audienceMammary epithelial cells grow and develop with the onset of sexual maturity. In addition, lobular alveolar structures are formed during pregnancy, and quiescent differentiated cells secrete high levels of milk proteins after parturition. These events are governed by multiple hormones and growth factors and involve the sequential and synergistic action of functionally distinct signal transduction pathways. Milk protein genes have been analyzed and composite response elements have been identified in the promoter sequences. Transcription factors, which relay the hormonal signals, bind to these sequences. The factor that confers prolactin simulation to milk protein gene transcription has recently been identified. MGF/Stat5 is a latent transcription factor that becomes activated by a tyrosine-specific protein kinase, Jak2, associated with the prolactin receptor. Tyrosine phosphorylation converts the latent factor into one with DNA-binding and transcriptional activation potential. The regulation of MGF/Stat5 in vitro and in vivo indicates that it is a central component of the lactogenic hormone signaling pathway. Involvement of MGF/Stat5 in the signaling by other cytokines indicates that the same factor might be involved in regulation of growth-promoting genes, primarily in hematopoietic cells

Interaction with the nuclear matrix of a chimeric construct containing a replication origin and a transcription unit

International audienceWe have studied the interaction of a chimeric construct containing an origin of replication (from bovine papilloma virus) and a hormonally regulated transcription unit (long terminal repeat from the mouse mammary tumor virus, driving the v-Ha-ras gene) with the nuclear scaffold and matrix from mouse fibroblasts. We used two experimental approaches because the nuclear matrix protein composition depends largely on the isolation conditions, making its definition mostly operational. In situ studies and in vitro experiments performed in 1361.5 cells, a cell line in which multiple copies of the construct have been established, indicate that two interesting regions of the construct interact with the nuclear matrix. The first region is located in the v-Ha-ras gene 5'-flanking sequences. These sequences come from the Harvey virus and contain a piece of the virus like 30S (VL30) sequences in which the v-Ha-ras gene is embedded. This DNA fragment was coupled to the thymidine kinase (TK) promoter driving the reporter luciferase gene and assayed in transient transfection experiments. Its insertion, in the sense orientation, upstream of the TK promoter resulted in a moderate enhancement (2-3-fold) of the luciferase activity. The second region is the most interesting from a physiological point of view. It contains the plasmid maintenance sequence 1 (PMS-1) and the core origin of replication of the bovine papilloma virus. Differences in the results from in situ (nuclear scaffold) and in vitro (nuclear matrix) experiments suggest that the components involved in the interaction with PMS-1 and the viral origin of replication are different. This may be of importance in the context of the recently proposed view that PMS-1 could be part of a composite origin of replication and provide information at a distance

Tocilizumab Contributes to the Inflammatory Status of Mature Dendritic Cells through Interleukin-6 Receptor Subunits Modulation

Tocilizumab, a humanized anti-IL-6 receptor α (IL-6Rα) is widely used in the treatment of a panel of pathologies such as adult and juvenile rheumatoid arthritis (RA) and the systemic form of juvenile idiopathic arthritis in children. Its indications are expected to be largely extended to other inflammatory diseases in close future. Dendritic cells (DCs) appear to be deeply involved in the immunopathology of these diseases, yet the effects of tocilizumab on these cells were poorly studied. In this study, we explored the effect of tocilizumab on the regulation of IL-6R subunits [gp130, soluble form of IL-6Rα (sIL-6Rα), and mIL-6Rα] in human monocyte-derived DCs. Human DCs were derived from CD14+ monocytes purified with beads with IL-4 and granulocyte macrophage colony-stimulating factor. Ex vivo cultures of DCs were performed in the presence of tocilizumab. Using lipopolysaccharide (LPS) maturation of DCs, we demonstrated that tocilizumab did not inhibit IL-6 secretion, enhanced mIL-6Rα expression, and largely increased sIL-6Rα secretion. MAPK modulated STAT3 phosphorylation and surface expression of IL-6Rα in LPS-DCs. Tocilizumab had no impact on STAT3 phosphorylation in LPS-DCs while both LPS and IL-6 increased its activation. Tocilizumab modulated the regulation of IL-6R subunits leading to an inflammatory status of DCs and a massive secretion of IL-6Rα. Our results demonstrate that DCs acquire a pro-inflammatory profile following tocilizumab treatment, becoming a major source of IL-6 trans-signaling activation that might explain the poor clinical benefit in some RA patients