La Sharka tipo Marcus (M), una grave enfermedad del melocotonero

Plum pox virus (PPV) causa la enfermedad de la sharka en frutales de hueso. Se trata de la enfermedad viral más grave del albaricoquero y ciruelo y también del melocotonero, cuando están presentes ciertos aislados del virus denominados Marcus (M) o tipos recombinantes con M (Rec). En España sólo se han dispersado aislados comunes o D del virus, pero existe riesgo real de introducción de aislados M agresivos en melocotonero, que podrían incidir gravemente en la producción temprana española. De hecho, un foco de PPV-M fue detectado y erradicado en Aragón en 2002. Los aislados Marcus se están dispersando por la cuenca del Mediterráneo y tienen una incidencia importante en ltalia y Francia, países con los que se mantiene un frecuente tráfico de material vegetal. La precaución y la vigilancia de fruticultores, viveristas y técnicos, debiera poderevitarla introducción y dispersión de aislados agresivos PPV-M en España. Se dispone técnicamente de sistemas de diagnóstico específicos que permiten la detección específica de cepas Marcus de forma fiable. Estos métodos, disponibles comercialmente, han sido transferidos a los Servicios de Sanidad Vegetal de las distintas Comunidades Autónomas

Evaluación en campo de la resistencia de líneas transgénicas de ciruelo europeo (Prunus domestica L.) a Plum pox virus

La sharka es la enfermedad viral más grave de frutales de hueso. Afecta especialmente a albaricoquero, melocotonero y ciruelo produciendo deformación, pérdida de calidad y caída prematura de los frutos. Esto causa importantes pérdidas económicas en la industria de frutales de hueso. El agente causante de la sharka es Plum pox virus (PPV). PPV se transmite a través de pulgones y mediante injerto, siendo el transporte y uso ilegal de material infectado la principal causa de la dispersión de la enfermedad a larga distancia. Existen programas de mejora encaminados a la obtención de variedades de prunus resistentes a PPV. Sin embargo, el largo tiempo que requiere esta técnica unido a la naturaleza poligénica de la resistencia y a la falta de fuentes de resistencia compatibles han hecho que se obtengan escasos éxitos y únicamente en albaricoquero. Una técnica alternativa o complementaria es el uso de la resistencia derivada del patógeno (PDR) mediante la obtención de plantas transgénicas que expresan un gen viral. Esto confiere a la planta resistencia frente al virus del cual procede el gen y frente a virus relacionados. En este sentido, Scorza et al. (1994) obtuvieron líneas de ciruelo europeo (Prunus domestica L.) que expresan el gen de la proteína de la cápsida de PPV. En condiciones de invernadero estas líneas transgénicas mostraron distintos grados de sensibilidad a la infección por PPV, con excepción de la línea C5 que demostró ser altamente resistente a la infección natural (a través de pulgones) de PPV. Cuando las plantas CS se inocularon mediante injerto, se desarrolló una infección muy leve y sólo en zonas localizadas de las plantas

OBTENTION OF SPECIFIC MONOCLONAL ANTIBODIES AND ANTISERA AGAINST XYLELLA FASTIDIOSA AND THEIR USE FOR DETECTION AND DIAGNOSIS

Monoclonal antibodies (MAb) specific to Xylella fastidiosa were obtained by fusion of a nonsecreting myeloma cell line with spleen cells from immunized BALB/c mice by intraperitoneal injections of 0.1 ml of 108 cfu/ml of X. fastidiosa subsp. fastidiosa (LMG17159 strain) (somatic antigens O) emulsified in Freund’s incomplete adjuvant. Specific antibody-secreting hybridoma selected by indirect-ELISA was three times cloned under conditions of limiting dilution and established hybrids were grown in HT medium. Ten MAb lines producing the highest bacterial titre were selected, isotype determined and their specificity tested. Three MAbs (MAb2G1/PPD, MAb1C6/PPD and MAb9F7/PPD) were selected for their wide reaction spectrum against X. fastidiosa strains and good specificity. Furthermore six polyclonal antisera against X. fastidiosa were raised in CalifornianxNeozelander rabbits with O antigens from Conn Creek, LMG15099 and LMG17159 strains. LMG17159-O antiserum was selected for the higher titre and because it recognized all the X. fastidiosa strains challenged. Polyclonal immunoglobulins as trapping/coating antibodies and specific MAb2G1/PPD as intermediate-detecting antibodies (DASI-ELISA method) reached a sensitivity of 105 cfu/ml of Xylella fastidiosa in almond extracts and of 105-106 in olive extracts. A DAS-ELISA prototype was then developed, prior to commercial distribution, using MAb2G1/PPD conjugated with alkaline phosphatase. The sensitivity reached was 105 cfu/ml and showed excellent specificity. One hundred twelve samples of different almond tree plots from the Demarcated Zone for X. fastidiosa in Alicante (Spain) were analysed comparatively by the developed DAS-ELISA, the LOEWE kit and the protocols of real-time PCR by Harper et al. (2010) and Francis et al. (2006). The agreement between the techniques was almost perfect according to the estimated Cohen’s kappa index, even in symptomless almond trees. The production of specific MAbs to X. fastidiosa will supply a continuous source of homogenous and well characterized antibodies to increase the accuracy of diagnosis and detection methods. A direct tissue-print or DTBIA kit is being also validated in order to supply an available user-friendly system to test in a low cost, fast, discreet, sensitive, an accurate manner this harmful bacterium in samples from nurseries, gardens and wide surveys, such as is available for other plant pathogens

Field trials of plum clones transformed with the Plum pox virus coat protein (PPV-CP) gene

Transgenic clones C2, C3, C4, C5, C6, and PT-6, of plum (Prunus domestica L.) transformed with the coat protein (CP) gene of Plum pox virus (PPV), PT-23 transformed with marker genes only, and nontransgenic B70146 were evaluated for sharka resistance under high infection pressure in field trials in Poland and Spain. These sites differed in climatic conditions and virus isolates. Transgenic clone C5 showed high resistance to PPV at both sites. None of the C5 trees became naturally infected by aphids during seven (Spain) or eight (Poland) years of the test, although up to 100% of other plum trees (transgenic clones and nontransgenic control plants) grown in the same conditions showed disease symptoms and tested positively for PPV. Although highly resistant, C5 trees could be infected artificially by chip budding or via susceptible rootstock. Infected C5 trees showed only a few mild symptoms on single, isolated shoots, even up to 8 years post inoculation. These results clearly indicate the long-term nature and high level of resistance to PPV obtained through genetically engineered resistance