Estudio de la localización de canales K2P en entornos lipídicos en neuronas granulares de cerebelo

72 p.Los canales de potasio (K+) forman parte de una de las familias más abundantes de proteínas de transmembra. Estas proteínas, y en particular los canales de K+ de dos dominios de poros (K2P), permiten el flujo de iones K+ a través de la membrana plasmática controlando de esta forma la excitabilidad en las células neuronales. En mamíferos se han identificado 15 canales de tipo K2P, también conocidos como canales de tipo leak, los que son agrupados en 6 subfamilias basados en sus propiedades estructurales y funcionales. Cada subunidad K2P está formada por cuatro segmentos de transmembrana (4STM) y dos dominios formadores de poro (2P), debiendo dimerizar para la formación de un poro selectivo y funcional. Estudios realizados en nuestro laboratorio, han demostrado que la alteración de los niveles de colesterol presentes en la membrana plasmática, generan una disminución de la corriente de tipo leak en neuronas granulares de cerebelo (NGC). Sin embargo, la asociación entre los dominios ricos en colesterol y los canales K2P no había sido estudiada. En esta tesis evaluamos la expresión de los canales K2P en células NGC y su colocalización con marcadores de balsas lipídicas, mediante técnicas bioquímicas y de biología celular. Nuestros resultados confirmaron la presencia de los canales K2P1, -3, -9 y -18 en NGC de rata mediante estudios de Western Blot e Inmunofluorescencia. Además se evaluó su colocalización con marcadores de balsas lipídicas. Se encontró una colocalización con caveolina, marcador de balsas lipídicas asociadas a caveolas, del ~56% para K2P1, ~33% para K2P3, ~41% para K2P9 y ~27% para K2P18. Por otro lado, con flotilina que es un marcador de balsas lipídicas no asociados a caveolas se encontró una colocalización del ~21% en el caso de K2P1, un ~27% para K2P3, ~54% para K2P9 y ~46% para el canal K2P18. También se identificó una fracción de canales expresados en la membrana que no están asociados a balsas lipídicas, lo que fue evaluado mediante la colocalización con el marcador β-adaptina, presentando un rango de ~26% a ~53% de colocalización./ABSTRACT: Potassium (K+) channels form part of one of the most abundant transmembre proteins super-families. These proteins, particularly the two-pore domain potassium (K2P) channels, allow the flow of K+ ions through the plasma membrane thereby modulating the excitability of neuronal cells. In mammals, K2P channels family is formed by 15 members, also known as potassium leak channels, which are divided in 6 subfamilies based on the structural and functional properties. Each K2P subunit contains four trasmembrane domains (4STM) and two pore forming domains in tandem (2P), and must dimerize to form a selective and functional pore. Studies in our laboratory have shown that cholesterol disruption of the plasma membrane generates a decrease of leak potassium current in cerebellar granule neurons (CGN). However, the association between cholesterol-rich domains and K2P channels had not been studied. In this thesis, we evaluated the expression of K2P channels in CGN cells and the colocalization with lipid rafts markers, using molecular biology and immunological approaches. Our results confirmed the presence of K2P1, -3, -9, and -18 channels in CGN using Western blotting and immunofluorescence studies. Moreover, its colocalization with lipid rafts markers was assessed. Colocalization with caveolin, a marker of lipid rafts associated with caveolae, was found of ~56% for K2P1, ~33% for K2P3, ~41% for K2P9 and ~27% for K2P18. Furthermore, with flotillin, a lipid rafts not associated with caveolae marker, was found a colocalization of ~21% for K2P1, ~27% for K2P3, ~54% for K2P9 and ~46% for K2P18. Finally, a fraction of channels that are not associated with lipid rafts was identified, which was assessed by colocalization with β-adaptin marker, presenting a range of ~26% to ~53% of colocalization

Identificación in silico de genes posiblemente asociados a la actividad probiótica de una cepa de Lactococcus de origen chileno

79 p.La acuicultura es una actividad de creciente énfasis en el país y se sustenta principalmente en la industria de la trucha y el salmón. Este último es el principal responsable de las exportaciones nacionales totales relacionadas con acuicultura y tiene como destino más de 100 países en todo el mundo. Como consecuencia existe gran interés en el control de enfermedades en estos peces, con especial énfasis en aquellas de origen bacteriano. El tratamiento de las mismas hasta hace algunos años se basaba principalmente en el uso de antibióticos que, si bien cumplen su función, constituyen un riesgo a futuro ante el eventual desarrollo y acumulación de genes de resistencia en los microorganismos patógenos. Hoy se utilizan principalmente vacunas, que a pesar de que dan buenos resultados presentan ciertas limitaciones. A esto se suma que ejercen su efecto en el sistema inmune adaptativo, cuando en peces es el sistema inmune innato el que tiene un rol más protagónico. Por esta razón, la mirada está puesta en el uso de probióticos autóctonos, en este caso, bacterias propias de salmón que poseen características beneficiosas para el control de enfermedades del mismo mediante la estimulación del su sistema inmune y la exclusión competitiva de bacterias patógenas. Esta memoria está orientada al análisis de una cepa autóctona del genero Lactococcus con promisoria proyección como probiótico. Dicho análisis tiene una orientación bioinformática y comprenderá el ensamble y la anotación del genoma en cuestión para lograr identificar genes relacionados con la actividad probiótica de esta cepa./ABSTRACT: Aquaculture is an activity of growing interest in the country and is principally maintained in trout and salmon industries. The last one is the main responsible of total national exports related with aquaculture and has in destiny more than 100 countries in the whole world. In consequence there is important interest in disease control of this fishes, with special emphasis in that one with bacterial origin. The treatment of selves until a few years was principally based on the use of antibiotics which, although execute successful its function, comprise a future risk by the eventual development and accumulation of resistance genes in pathogenic organisms. Actually, vaccines are the main treatment used, which although give good results, presents some difficulties. Also vaccines act over adaptive immune system, when in fishes, is the innate immune system the most important. For this reason the global focus is over the use of indigenous probiotics, in this case, the own bacteria of salmon that possess beneficial characteristics to disease control in this fishes through stimulation of its immune system and the competitive exclusion of pathogenic bacteria. This thesis is oriented to analysis of indigenous strain of the genus Lactococcus with promissory projection as a probiotic. This analysis has a bioinformatics focus and include the assembly and genome annotation to achieve the identification of genes related with the probiotic activity of this strain

Generación y evaluación funcional de dominantes negativos para canales K2P

54 p.Los iones potasio difunden rápidamente a través de la membrana mediante proteínas llamadas canales de potasio. Este movimiento subraya muchos procesos biológicos fundamentales, incluyendo señalización eléctrica en el sistema nervioso. Estos canales muestran una alta selectividad a iones potasio, y la permeabilidad a iones más pequeños es extremadamente baja. Todos los canales de potasio sin excepción, presentan una secuencia aminoacídica crítica en el dominio formador de poro, conocida como la secuencia firma TVGYG en la cual las glicinas (G) se encuentran muy conservadas. La secuencia firma de los canales de potasio juega un rol importante en la selectividad a este ión, ya que su ordenamiento estructural específico, orientando los oxígenos de los grupos carbonilos del backbone hacia el poro, hace que estos actúen como reemplazo de la capa de solvatación del ión, logrando la conducción iónica, que se produce por una simple razón: la repulsión entre los iones es más fuerte que la atracción del ión hacia el sitio de unión dentro del filtro. La mutación de la primera glicina del segundo dominio formador de poro de los canales K2P9 y K2P10 por un ácido glutámico, genera cambios estructurales dentro del filtro de selectividad, haciendo que en primer lugar, los oxígenos de la cadena lateral del ácido glutámico se orienten hacia el interior del poro e interaccionen con el ión, y en segundo lugar, cambios en la orientación de los oxígenos de los grupos carbonilos del backbone de los aminoácidos del filtro de selectividad, teniendo como resultado canales no funcionales, que muestran una densidad de corriente nula en comparación con las corrientes de los canales Wild Type.Palabras claves: K2P./ABSTRACT: Potassium ions diffuse rapidly across membrane through proteins known as potassium channels. This movement highlight a lot of fundamental biological processes, including electric signaling in nervous system. These channels show a high selectivity to potassium ions, and a lower permeability to smaller ions. All potassium channels, without exception, have a critical amino acidic sequence in their pore domain, known as the signature sequence TVGYG with highly conserved glycines (G).The signature sequence of potassium channels plays an important role in the ion selectivity. Carbonyl oxygens from backbone of the filter act as hidratation shield substitutes, so the conduction is possible by a simple reason: the repulsion force between the ions is higher than the affinity between ion and binding site in the filter. Mutation of the first glycine in the second pore domain by a glutamic acid in K2P9 and K2P10 channels, produce structural changes in the selectivity filter: first, the oxygens from the lateral chain of glutamic acid is oriented to the pore and can interact with the K+, and second, changes the orientation of carbonyl oxygens from amino acids backbone in the selectivity filter. These changes result in non functional channels, showing a low density of current compared with the wild type currents. Key words: K2P

Estudio fisiológico y molecular del rol de etileno y aba durante la maduración de la papaya cultivada en Chile (Vasconcellea pubescens

79 p.La papaya de montaña (Vasconcellea pubescens) es una especie exótica, perteneciente a la familia Caricaceae y nativa de las regiones andinas de América del Sur, introducida en Chile hace más de 50 años, cultivándose en zonas costeras y protegidas de heladas. El fruto de V. pubescens posee atractivas características organolépticas y nutricionales, como un agradable sabor y aroma, además de su gran contenido de vitaminas y antioxidantes. La producción del fruto es más bien artesanal y el tiempo de postcosecha es reducido (7 a 9 días), implicando perdidas sustanciales y provocando un impacto económico para los productores de fruta fresca y elaborada, como es en su presentación en conserva, mermelada, miel y zumo. En este contexto y con el objetivo de mejorar nuestro entendimiento del proceso de ablandamiento del fruto de papaya de montaña se procedió a realizar un seguimiento de los cambios que ocurren durante su maduración.Los resultados confirman la naturaleza climatérica del fruto y su rápido ablandamiento, que incide en su corta vida de postcosecha. Además tanto la aplicación de etileno, como ABA adelantaron y/o aumentaron la tasa de ablandamiento del fruto. Por el contrario, las muestras tratadas con 1.MCP y Fluridona mostraron un retraso en el ablandamiento, lo que siguiere en conjunto que existen componentes regulados por estas dos hormonas durante la maduración de la papaya de montaña Con el propósito de esclarecer a nivel genético-molecular los mecanismos que subyacen al ablandamientos del fruto, se realizó la identificación a gran escala de genes que estén involucrados en el ablandamiento del fruto, debido a que es una de las características fisiológicas que más afecta la calidad del fruto. Para lo cual a partir de los resultados del año 1 del proyecto FONDECYT N°11100481, los cuales consistieron en la obtención del transcriptoma del proceso de maduración, con especial énfasis en el ablandamiento de la papaya de montaña, mediante la técnica de pirosecuenciación 454, se obtuvo una compleja lista de ESTs, de los cuales fueron seleccionados algunos genes candidatos de acuerdo a la evidencia experimental en otros frutos de su acción VIII en el ablandamiento, como es la especie modelo de maduración Solanum lycopersicum. Como resultado del análisis de verificación de la anotación funcional de las secuencias estudiadas se logró seleccionar un grupo de genes asociados al ablandamiento del fruto de papaya de montaña. Finalmente, se procedió al diseño de partidores de qPCR, lo cual permitirá validar experimentalmente los resultados de genómica funcional. Esta información podrá ser utilizada en el diseño de estrategias para aumentar atributos de calidad, costos asociados y disminución de pérdidas asociados al proceso de ablandamiento del fruto de papaya de montaña. Palabras claves: Papaya de montaña, Vasconcellea ubescens,ablandamiento/ABSTRACT: pubescens, mountain papaya (Vasconcellea pubescens) is an exotic species,belonging to the family Caricaceae and native to Andean regions of South America, introduced in Chile over 50 years ago, cultivated in coastal areas and protected from frost. The fruPalabrasit of V. pubescens has attractive organoleptic and nutritional characteristics, as a pleasant taste and aroma, in addition to its high content of vitamins and antioxidants. The fruit production is more artisanal and postharvest time is reduced (7-9 days), implying substantial losses and causing economic impact for producers of fresh and processed fruit, as in canned presentation, jam, honey and juice. In this context and in order to improve our understanding of the process of softening of mountain papaya fruit proceeded to track the changes that occur during ripening. The results confirm the nature climacteric fruit and its rapid softening, which affects its short postharvest life. Furthermore both application of ethylene, as ABA forward and / or increased rate of fruit softening. By contrast, samples treated with Fluridone 1.MCP and showed a delay in softening, which follows ther existing components together these two hormones regulated during maturation of the mountain papaya In order to elucidate the molecular-genetic level mechanisms underlying the softening of the fruit, was performed on a large scale identification of genes that are involved in fruit softening, because it is one of the physiological characteristics that affects the fruit quality. To which after one year results of the project FONDECYT No. 11,100,481, which consisted in obtaining the transcriptome of the maturation process, with special emphasis on the softening of mountain papaya, using the 454 pyrosequencing technique, complex yielded a list of ESTs, of which some candidate genes were selected according to the experimental evidence in other fruits of his action in softening, as is the species Solanum lycopersicum maturity model. As a result of verification testing functional annotation of the sequences studied were able to select a group of genes associated with papaya fruit softening mountain. Finally, we proceeded to design qPCR primers, allowing experimentally validate the results of functional genomics. This information may be used in the design of strategies to enhance quality attributes associated costs and reduce losses associated with the process of softening of mountain papaya fruit. Keywords: Mountain Papaya, Vasconcellea pubescens, softening

Predicción de elementos móviles de DNA en Xenopus tropicalis

67 p.Los elementos móviles de DNA pueden trasladar segmentos de DNA dentro de un cromosoma, o entre cromosomas. Se caracterizan por poseer una secuencia que codifica para una proteína transposasa, y, flanqueándola, poseen segmentos de DNA terminales invertidos repetidos. La transposición puede afectar a corto plazo la regulación génica, y a largo plazo, la evolución de los organismos. Hay evidencia que sugiere que los elementos móviles de DNA están relacionados con la regulación del desarrollo neural en Xenopus laevis y Xenopus tropicalis.La tarea de identificación de elementos móviles de DNA es difícil, ya que existen 12 superfamilias distintas, las que comúnmente sufren una serie de mutaciones, perdiendo los patrones de secuencia característicos que estas poseen. Una manera de modelar una superfamilia es utilizando perfiles HMM. Estos perfiles incorporan aspectos estadísticos, dando cuenta de la divergencia de las secuencias de una superfamilia. Por esto, en este trabajo se desarrollaron perfiles HMM a partir de la curación rigurosa de secuencias de proteínas de cada una de las 12 superfamilias conocidas de elementos móviles de DNA.Los modelos desarrollados son más sensibles y selectivos que aquellos disponibles en PFAM. Además, el análisis de las predicciones permite realizar una clasificación de los resultados en términos de presencia o ausencia de Stops, fragmento o transposasa completa, y proteína derivada de transposasa.Las predicciones realizadas en el genoma y proteoma de Xenopus tropicalis muestran que la superfamilia Tc1/Mariner es la más prevalente (96% de las predicciones en el genoma y 82.4% de las predicciones en el proteoma) mientras que hay una fracción pequeña que corresponde a piggyBac, y otra fracción pequeña que corresponde a Merlin, que parece ser un elemento nuevo descrito en este organismo./ABSTRACT: DNA mobile elements can move DNA segments inside a chromosome or between chromosomes. They are characterized by a sequence that encodes a transposase protein and flanking it, DNA segments that are inverted repeated terminals. Transposition may affect, in the short term, gene regulation, and in the long term, organisms’ evolution. There is evidence suggesting that DNA mobile elements are linked to the regulation of Xenopus laevis and Xenopus tropicalis neural development. The identification of DNA mobile elements is a hard task, since there are 12 distinct families, which often suffer mutations, losing characteristic sequence patterns. Using profile HMMs is one method to model a family. These profiles incorporate statistical characteristics, accounting for the divergence amongst a family sequences. For this reason, in this work, HMM profiles were developed from the rigorous curation of the protein sequences of each of the 12 known superfamilies of DNA mobile elements. The models developed are more sensitive and more selective than those available in PFAM. Also, the analysis of predictions allows performing a classification of the results in terms of presence or absence of Stops, as fragments or complete transposase, and as transposase-derived protein.The predictions performed in Xenopus tropicalis genome and proteome show that the Tc1/Mariner family is the most prevalent (96% of the genome prediction and 82.4% of the proteome predictions), whereas there is a small fraction belonging to piggyBac, and another small fraction belonging to Merlin, which seems to be a new described element in this organis

Modelamiento molecular de la conexina CX46 para identificar sitios de unión a CA²+ y a lípidos.

103 p.Las conexinas corresponden a una familia de proteínas transmembranales. Seis subunidades de conexinas forman un canal iónico llamado “hemicanal” el cual es capaz de comunicar el citoplasma con el medio extracelular. Facilitando el intercambio de iones y moléculas pequeñas (< 1-2 kDa) entre el interior de las células y el espacio extracelular. La regulación de la apertura de los hemicanales, está determinada por la presencia de cationes divalentes (Ca²+) en el medio extracelular, como es el caso del hemicanal de Cx46 que se expresa en las células del cristalino. La Cx46 participa en el mantenimiento de la homeostasis del calcio intracelular y su falta provoca la aparición de cataratas. Por otra parte, estudios han demostrado que el ácido linoleico en bajas concentraciones (0,1 μM) aumenta las corrientes de los hemicanales formados por la Cx46, mientras que a concentraciones altas (100 μM) inhibe la función del canal. Dado que se desconoce cómo funciona la regulación de la Cx46 mediada por Ca²+ extracelular y por lípidos, se pretende estudiar su estructura y así determinar los sitios de unión a estos ligandos. Para ello se realizó un modelo comparativo de Cx46. Se utilizó un servidor web que buscan los aminoácidos de la proteína, con los cuales el Ca²+ pueda interactuar favorablemente. Además se analizaron en una simulación de dinámica molecular (DM) cómo el Ca²+ se une y/o permea el hemicanal de Cx46. Para estudiar la unión a ácido linoléico se realizó un acoplamiento molecular y a continuación una simulación molecular de DM, para ver cómo interactúa el complejo proteína-ligando. Se logró obtener los posibles sitios de unión a Ca²+ y ácido linoleico en la estructura de la Cx46, mediante los métodos anteriormente mencionados, donde el Ca²+ interactúa con bucles extracelulares de la Cx46 y el AL con segmentos transmembrana de este. Palabras claves: Conexina 46, ácido linoleico, Ca²+, cataratas./ABSTRACT:Connexins are a family of transmembrane proteins. Six subunits of connexins make a ionic channel called “hemichannel” which enable the communication of the cytoplasm with the extracellular medium. Facilitates the exchange of ions and small molecules (<1.2 kDa) between the inside of cells and the extracellular space. The regulation of the opening of hemichannels is determined by extracellular divalent cations (Ca²+), like the connexin 46 (Cx46) that is expressed in cells of the lens. Cx46 is involved in maintaining calcium homeostasis and its absence make activation of cataracts. Moreover, studies have shown that linoleic acid in low concentrations (0,1 μM) increases the hemichannel voltage formed by Cx46, whereas at high concentration (100 μM) inhibits the channel function. Because it is known how it provokes the regulation of Cx46 mediated by extracellular Ca2+ and by lipids, we need to study its structure to determine the putative binding sites for these ligands. To this was performed a comparative Cx46 model. We used web servers that search possible amino acids of the protein which could interact with Ca²+ favorably. Also was analyzed in a molecular dynamics simulation (DM) how the Ca²+ binds and/or permeates the hemichannel of Cx46. The study for linoleic acid binding, we perform a docking molecular and then a DM simulation for see how interact the protein-ligand complex.We obtain the putative Ca²+ and linoleic acid binding sites in the structure of Cx46, using the above methods, where Ca²+ interacts with the extracellular loops of Cx46 and AL with transmembrane segments of this.Keywords: Connexin 46, linoleic acid, Ca²+, cataracts

Análisis de expresión diferencial in silico de genes involucrados en la aclimatación a baja temperatura en Eucalyptus nitens mediante mRNA-Seq.

106 p.En Chile, según información del INFOR, en el año 2011 la superficie plantada de Eucalyptus spp. Fue de 740.360 hectáreas, de las cuales un 70,7% corresponde a Eucalyptus globulus y un 29,3% a Eucalyptus nitens. La importancia de este género se debe a su amplia adaptabilidad, rápido crecimiento, excelente madera y gran producción de biomasa. Sin embargo, la gran sensibilidad de E. globulus a las heladas restringe geográficamente la extensión de sus lantaciones, causando pérdidas económicas para los productores al considerar los años de crecimiento perdidos, el costo de reforestación y la pérdida de calidad de la madera. Por su parte, E. nitens es mucho más resistente a temperaturas congelantes, lo que lo convierte en una alternativa para plantar en rangos de ambiente donde E. globulus no puede ser plantado satisfactoriamente. Estudios revelan que la resistencia a baja temperatura de Eucalyptus spp. Posee un control a nivel genómico, lo que permite desarrollar mejoramiento genético en esta especie. El objetivo de este estudio fue identificar genes involucrados en el proceso de aclimatación a baja temperatura en E. nitens, mediante el análisis bioinformático de bibliotecas mRNA-Seq, ya que esta especie presenta una mayor tolerancia a temperaturas de congelamiento.Se realizaron bibliotecas de expresión mediante secuenciación del tipo NGS (Next-Generation Sequencing) de plantas de E. nitens sometidas a cuatro tratamientos de aclimatación, simulando la variación estacional anual, en condiciones de laboratorio (NA: No aclimatado, AAH: Aclimatado antes de la helada, ADH: Aclimatado despu´es de la helada y DA: Desaclimatado). Los análisis bioinformáticos involucraron el pre-procesamiento y limpieza de los datos obtenidos por secuenciación Ion Torrent, mapeo de las lecturas utilizando la información del genoma de referencia de Eucalyptus grandis, seguido de un análisis de expresión diferencial in silico en donde se compararon condiciones en pares (NA/AAH, NA/ADH, NA/DA, AAH/ADH, AAH/DA y ADH/DA), para identificar y caracterizar los genes involucrados en la aclimatación a baja temperatura en E. nitens. Luego se realizó un análisis de ontología genética de los genes diferencialmente expresados con el fin de conocer el significado biológico de estos, en base al proceso biológico, componente celular y función molecular asociada.El rango de genes diferencialmente expresados que fueron identificados, vario desde 126 a 590 en cada una de las comparaciones de tratamientos, donde la mayor parte de los genes de acuerdo a la clasificación por ontología genética, corresponden a genes que participan en procesos metabólicos, respuesta a estímulos, respuesta a estrés, procesos iosinteticos, procesos celulares, actividad catalítica, asociados al citoplasma, cloroplastos, membrana plasmática, pared celular y region extracelular./ABSTRACT: In Chile, according to INFOR, in 2011 the total forest area of Eucalyptus spp. was 740.360 hectares, of them 70,7% are Eucalyptus globulus and 29,3% Eucalyptus nitens. The importance of this genus is based on its wide adaptability, rapid growth and excellent wood quality.However, the main planted species; E. globulus is sensitive to freezing temperatures limiting the extension of its plantations to areas without frequent frost or areas with only episodic occurrence of temperatures below zero. In these areas this species is replaced by E. nitens, which exhibits a higher frost tolerance. Nevertheless, studies have shown that the frost tolerance in Eucalyptus spp. is controlled by genetic factors. The knowledge of genes and molecular processes involved in the cold tolerance will allow to improve breeding programs, focusing in the selection of frost tolerance genotypes and hybridization. The objective of this study was to identify genes involved in the molecular and cellular process of cold acclimation in E. nitens.Expression libraries were made by NGS (Next-Generation Sequencing) from plants of E. nitens subjected to four treatments acclimation, simulating the annual seasonal variation in controlled conditions (NA: Non-acclimated, AAH: Acclimated before frost, ADH: Acclimated after frost and DA: De-acclimated). The bioinformatics analysis included: 1) data preprocessing of the reads generated by Ion Torrent sequencing, 2) reads mapping to the reference genome of Eucalyptus grandis, 3) the generation of a table of reads counts followed by the analysis of differential gene expression in silico, where conditions were compared in pairs (NA/AAH, NA/ADH, NA/DA, AAH/ADH, AAH/DA and ADH/DA), to identify genes involved in acclimation to process in E. nitens by the differential expressed genes identified. The numbers of differentially expressed genes were from 126 to 590 in each treatment comparisons, where most of genes according to Gene Ontology (GO), were associated to metabolic processes, response to stimulus, response to stress, biosynthetic processes, cellular processes, catalytic activity; and associated with the cytoplasm, chloroplasts, plasma membrane, cell wall and extracellular region

Modelamiento molecular del factor de transcripción ANACO42 y su unión específica a elementos cis-regulatorios

69 p.La familia de proteinas NAC constituye una de las más grandes de factores de transcripción (FT) de vegetales, encontrándose en una gran variedad de plantas terrestres. Los miembros de esta familia tienen funciones biológicas diversas, participando en procesos de desarrollo embrionario, crecimiento de raíces, señalización y respuesta a estrés abiótico y senescencia . La denominación NAC proviene del nombre de tres genes independientemente. NAM (no apical meristem) de Petunia hybrid, ATAF1,2 y CUC2 (proveniente de ingles cup shaped cotyledon, cotyledon en forma de copa) de Arabidopsis thaliana. Las proteínas de esta familia forman dímeros funcionales para unirse al AND. Sólo una porción de las proteínas NAC ha sido estudiada a la fecha y tienen funciones diversas. Están involucradas en eldesarrollo de las plantas, en la defense, la senescencia y la respuesta a estrés abiótico, como en el caso de sequía. Las proteinas de la familia NAC se unen a elementos cis-regolatios del ADN a través de una cara de la estructura que se encuentra positívamente cargada. En esta tesis, se trabajó con la proteina NAC ANAC042, estudiándose su energía de union in silico a diferentes elementos cis-regulatorios del ADN. Se plantea que las energías de union a estos elementos cis-regulatorios indicarían a qué partes del ADN se une in vivo el factor de transcripción ANAC042. Se modeló por homología la proteína ANAC042 utilizando como templado la estructura crista lográfica de ANAC019 (código pdb 1UT7), se calculó el potencial electrostático para así corroborar laubicación de la cara del dímero que interactuará con el ADN y se generaron modelos 3D de loselementos cisregulatorios. Finalmente se realizaron ensayos de acoplamiento molecular utilizando el software HAD-DOCK entre la proteína ANAC042 y los elementos cisregolatorios. Se pudo comprobar que la zona de ANAC042 que une ADN comprende desde residuos Val115 hasta el residuo Val168 situados en el dominio NAC de la proteína. Por otro lado, las energías de interacción dan cuenta de dónde se une el ADN in vivo en el factor de transcripción ANAC042 al hacer una simulación in silico. Palabras Claves: ANAC042, elementos cis-regulatorios, NAC, F17d127

Modelamiento Molecular y Análisis Estructural de TASK–1, TASK–3 y TASK–2 en Interacción con A1899

111 p.Los canales de potasio con dos dominios de poro (K2P) son un tipo de canales iónicos selectivos, caracterizados por una topología de cuatro segmentos transmembranales (M1–M4) y dos dominios de poro por subunidad. Algunas de las funciones mejor estudiadas de estos canales incluyen la mantención del potencial de reposo, regulación de la excitabilidad celular,transporte de iones y regulación metabólica.Una dificultad para entender el rol de estas proteínas como blanco de agentes terapéuticos es la falta de farmacología selectiva. Es necesario entender cómo estos agentes terapéuticos actúan y modifican la estructura de los canales K2P para poder desarrollar drogas específicas. Actualmente sólo la molécula A1899 ha mostrado alta selectividad por distintos canales K2P y se han determinado experimentalmente los residuos de un canal K2P (TASK–1) involucrados en la interacción con el inhibidor, sin embargo, se desconoce el mecanismo molecular de unión de A1899 a estos canales. Estos datos fueron ocupados como base para determinar el sitio de unión específico de A1899 en canales K2P (TASK–1, TASK–3, TASK–2, TRAAK) utilizando simulaciones de acoplamiento molecular para determinar los complejos formados entre el sitio unión de cada receptor con el inhibidor. Posteriormente se realizaron simulaciones de dinámica molecular de los complejos receptor–ligando para evaluar la estabilidad termodinámica y molecular de los complejos obtenidos por acoplamiento molecular. Los resultados conseguidos detallan la relación constituida entre A1899 y los canales K2P, y sugieren cómo este inhibidor bloquea cada canal de forma distinta, mostrando buena correlación con los datos electrofisiológicos reportados. Pese a que los resultados concuerdan con la información biológica reportada, es necesario realizar análisis adicionales con el fin de sustentar los resultados y determinar la contribución individual de cada residuo involucrado en el bloqueo de los canales K2P./ABSTRACT: Two–pore–domain potassium channels (K2P) are one kind of selective ion channels,characterized by a four transmembrane domain (M1–M4) topology and two pore–forming domains per subunit. Some of the most studied roles of K2P channels include the maintenance of the resting potential, regulation of the excitability of the cells, ion transport and metabolic regulation. A major difficulty to understand the role of these channels as therapeutic targets is the lack of selective pharmacology. It is necessary to understand how these therapeutic agents act and modify the structure of K2P channels to develop specific drugs. To date only the molecule A1899 has shown high selectivity for ifferent K2P channels. The residues involved in the formation of the drug binding site of one K2P channel (TASK–1) have been identified, nevertheless, the binding mechanism of A1899 to these channels is unknown. These data were taken as basis for determining the specific binding site for A1899 in K2P channels (TASK–1, TASK–3, TASK–2, TRAAK) by using docking simulations to determine complexes between receptor’s binding site and the inhibitor. Subsequently, molecular dynamics of receptor–ligand complexes were performed to study the thermodynamics and the structural properties of the complexes achieved by docking. The obtained results describe the relationship between A1899 and K2P channels, and suggest how this molecule blocks each channel differently, showing good agreement with reported electrophysiological data. Although the results agree with biological information available, further analyses are required to support the findings and establish the individual contribution of each residue involved in the K2P channel block

Estudio de la conducta de selección de plantas hospederas y genes de olfato en genotipos del áfido Sitobion avenae (Homoptera: Aphididae) que difieren en el número de rhinarias secundarias

50 p.El proyecto se centra en el estudio de las diferencias intraespecíficas asociadas a individuos de dieta especialista y generalista del áfido del grano, Sitobion avenae. Se ha observado que algunos ejemplares de esta especie poseen una mayor cantidad de sensores olfativos (rhinarias) en sus antenas, lo que estaría asociado a una mayor selectividad a la hora escoger una planta hospedera.La investigación contempló dos etapas. En la primera, se sometió a especímenes de ambos genotipos a ensayos de selección, presentándoles distintas variedades de plantas hospederas, para estudiar el comportamiento de selección de estos áfidos. La segunda parte se centró en estudiar algunos genes relacionados con olfato y analizar las variaciones entre estos individuos. Este análisis se llevó a cabo con el fin de identificar las secuencias que marcarían la diferencia entre los especialistas y generalistas, esto es, aquellas correspondientes a los genes que podrían definir la conducta de selección de hospedero y cantidad de rhinarias asociadas. Los resultados obtenidos en los ensayos de selección permitieron observar variaciones en los patrones de comportamiento de selección de hospedero entre genotipos especialistas y generalistas de S. avenae. Por otro lado, los análisis en gel de agarosa de los resultados de PCR para los distintos genes, mostró diferencias en la presencia de estos genes relacionados con la capacidad olfativa. Tras obtener los resultados de la secuenciación de algunos de estos genes, se les aplicó un Blast para estudiar sus relaciones más cercanas y de esta forma confirmar que codifican para proteínas relacionadas con funciones olfativas. Palabras clave: Rhinaria, especialista, generalista I./ABSTRACT:The proposed study is centered in the instraspecific differences that determine the specialist and generalist specimens of the aphid Sitobion avenae. Individuals of this species have been observed to posses a greater amount of olfatory sensilla (rhinaria) in their antennae, which could be associated to a greater selectivity when choosing a host plant. The study contemplated two stages. Fist, individuals of each genotype were presented with different varieties of host plants, to study the selective behavior of this aphids through selection essays. The second part of the study focused on the extraction of DNA and RNA from the insects to study transcriptomic differences of genes related to the olfaction and to analyze the variations between individuals. This analysis would allow the identification of sequences which could explain the differences between specialist and generalist S. avenae, this is, sequences correspondent to genes which could define host selection behavior and amount of associated rhinaria. Results obtained from the selection essays allowed assess of variations in host selection behavioral patterns between generalist and specialist S. Avenae individuals. On the other hand, agarose gel analyisis of the PCR results for the differents genes, showed differences in the presence of these smell-related genes. After getting results from the sequencing of some of these genes, a Blast was applied to study their closest relationships, thus confirming they codify for smell-related proteins. Key words: Rhinaria, specialist, generalis