Towards selection on F4 enterotoxigenic Escherichia coli resistance in pigs for prevention of neonatal and post-weaning diarrhea

F4 enterotoxigene Escherichia coli (F4 ETEC) is een belangrijke oorzaak van diarree bij pasgeboren en pasgespeende biggen en is verantwoordelijk voor grote economische verliezen in de varkenshouderij. De bacteriën hechten zich met F4 fimbriae (F4ab, F4ac en F4ad) vast aan de receptoren in de dunne darm. Door deze vasthechting kan F4 ETEC de intestinale peristaltiek overwinnen waardoor bacteriële kolonisatie in de dunne darm kan plaatsvinden. Vervolgens produceren deze bacteriën enterotoxines die verantwoordelijk zijn voor de symptomen van diarree. Omdat de expressie van F4-specifieke receptoren genetisch bepaald is in het varken, kan een diagnostische genotyperingstest ontwikkeld worden voor de selectie van F4 ETEC resistente varkens. Door deze dieren bij voorkeur te gebruiken in fokprogramma’s, kan het aantal uitbraken van F4 ETEC-geïnduceerde diarree in de varkensindustrie gereduceerd worden. Echter werd er tot op heden geen oorzakelijke mutatie gevonden voor F4 ETEC gevoeligheid in biggen. Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de huidige literatuur over F4 ETEC bij biggen weer. Het doel van dit doctoraatsonderzoek was om de oorzakelijke mutatie(s) evenals het doelwitgen of -genen te identificeren en om zo een nieuwe diagnostische genotyperingstest te ontwikkelen op basis van de geïdentificeerde causale mutatie(s). Twee verschillende benaderingen werden in parallel toegepast (Hoofdstuk 2). De eerste benadering was om via een genoomwijde associatiestudie (GWAS) met behulp van de Porcine SNP60 DNA BeadChip (Hoofdstuk 3) de kandidaatregio voor F4ab/ac ETEC gevoeligheid op chromosoom 13 te verfijnen. De verfijnde kanidaatregio van 183 kb geïdentificeerd in deze thesis bevat geen geannoteerde genen, leidende tot de conclusie dat de eerder voorgestelde kandidaatgenen op chromosoom 13 niet verantwoordelijk zijn voor F4ab/ac ETEC gevoeligheid. Vervolgens werd er een gebied van 85 kb met de sterkst geassocieerde SNPs (SNP1, SNP2 en SNP3) binnen de kandidaatregio geselecteerd en gesequeneerd in F4ab/ac receptor-positieve en F4ab/ac receptor-negatieve biggen om de causale mutatie(s) (Hoofdstuk 6) te identificeren. Tijdens deze sequenering werden er 725 mutaties geïdentificeerd waarvan 274 mutaties een correlatie vertoonden met het F4ab/ac ETEC fenotype. De tweede benadering was om te onderzoeken of een genetische variatie in het gen coderend voor ANPEP, geïdentificeerd als F4ac receptor, (Hoofdstuk 4) en in genen betrokken in de assemblage van het F4-bindend suikerdeel van glycosfingolipiden (Hoofdstuk 5) verantwoordelijk kan zijn voor de F4 ETEC gevoeligheid in biggen. Hoewel deze genen niet gelokaliseerd zijn in de kandidaatregio is het mogelijk dat de oorzakelijke mutatie regulerende effecten uitoefent op genen waarvan de coderende delen buiten de grenzen van de geïdentificeerde kandidaatregio liggen. Het resultaat van deze studies concludeert dat F4 ETEC gevoeligheid niet veroorzaakt wordt door een genetische variatie in de onderzochte genen. Hoewel er geen causale mutatie(s) of doelwitgen(en) voor F4 ETEC gevoeligheid geïdentificeerd werden (Hoofdstuk 6), suggeren de resultaten van deze thesis dat de kandidaatregio op chromosoom 13 een trans-werkend element bevat dat genen die een rol spelen in de adhesie van F4ab/ac ETEC aan de dunne darm beïnvoedt en waarvan de coderend delen gelegen zijn buiten de kandidaatregio. Ook werd er een nieuwe merker, SNP2, voorgesteld om te gebruiken in een genotyperingstest met een betrouwbaarder resultaat tot gevolg dan eerder voorgestelde DNA-testen. Deze SNP2-genotyperingstest wordt momenteel uitgevoerd in het Laboratorium voor Dierlijke Genetica

Variation in 12 porcine genes involved in the carbohydrate moiety assembly of glycosphingolipids does not account for differential binding of F4 Escherichia coli and their fimbriae

Background: Glycosphingolipids (GSLs) are important membrane components composed of a carbohydrate structure attached to a hydrophobic ceramide. They can serve as specific membrane receptors for microbes and microbial products, such as F4 Escherichia coli (F4 ETEC) and isolated F4 fimbriae. The aim of this study was to investigate the hypothesis that variation in genes involved in the assembly of the F4 binding carbohydrate moiety of GSLs (i.e. ARSA, B4GALT6, GAL3ST1, GALC, GBA, GLA, GLB1, GLB1L, NEU1, NEU2, UGCG, UGT8) could account for differential binding of F4 ETEC and their fimbriae. Results: RT-PCR could not reveal any differential expression of the 12 genes in the jejunum of F4 receptor-positive (F4R(+)) and F4 receptor-negative (F4R(-)) pigs. Sequencing the complete open reading frame of the 11 expressed genes (NEU2 was not expressed) identified 72 mutations. Although some of them might have a structural effect, none of them could be associated with a F4R phenotype. Conclusion: We conclude that no regulatory or structural variation in any of the investigated genes is responsible for the genetic susceptibility of pigs towards F4 ETEC

Maternal immunity enhances systemic recall immune responses upon oral immunization of piglets with F4 fimbriae

F4 enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC) cause diarrhoea and mortality in piglets leading to severe economic losses. Oral immunization of piglets with F4 fimbriae induces a protective intestinal immune response evidenced by an F4-specific serum and intestinal IgA response. However, successful oral immunization of pigs with F4 fimbriae in the presence of maternal immunity has not been demonstrated yet. In the present study we aimed to evaluate the effect of maternal immunity on the induction of a systemic immune response upon oral immunization of piglets. Whereas F4-specific IgG and IgA could be induced by oral immunization of pigs without maternal antibodies and by intramuscular immunization of pigs with maternal antibodies, no such response was seen in the orally immunized animals with maternal antibodies. Since maternal antibodies can mask an antibody response, we also looked by ELIspot assays for circulating F4-specific antibody secreting cells (ASCs). Enumerating the F4-specific ASCs within the circulating peripheral blood mononuclear cells, and the number of F4-specific IgA ASCs within the circulating IgA+ B-cells revealed an F4-specific immune response in the orally immunized animals with maternal antibodies. Interestingly, results suggest a more robust IgA booster response by oral immunization of pigs with than without maternal antibodies. These results demonstrate that oral immunization of piglets with F4-specific maternal antibodies is feasible and that these maternal antibodies seem to enhance the secondary systemic immune response. Furthermore, our ELIspot assay on enriched IgA+ B-cells could be used as a screening procedure to optimize mucosal immunization protocols in pigs with maternal immunity