3 research outputs found
The role of the TRPS1 transcription factor in skeletal development
Ziel dieser Arbeit war, die Wirkung des Transkriptionsfaktors TRPS1 besser zu verstehen und in Komplexe und Signalwege einzuordnen, um die Pathogenese der assoziierten Erkrankung aufzuklären.
Im ersten Teil sollten direkte Zielgene von TRPS1 identifiziert und verifiziert werden, um Einsicht in die zelluläre Funktion dieses einzigartigen Transkriptionsfaktors zu bekommen. Hierzu sollte zum einen die Methode der ChIP-Seq unter Verwendung von chondrogen differenzierten ATDC5-Zellen dienen. Vorab wurde die Trps1-Expression in diesem System auf Proteinebene untersucht. Da der Trps1-Level acht Tage nach Induktion zum chondrogenen Wachstum maximal ist, wurden eben solche Zellen als Ausgangsmaterial für die Chromatinimmunpräzipitation verwendet. Leider konnte die erhoffte Anreicherung von Zielgenpromotoren mittels PCR-basierter Kontrollen nicht nachgewiesen werden. Aufgrund der unklaren Ausbeute der ChIP, wurde von der anschließenden Hochdurchsatzsequenzierung abgesehen. Da die Umstellung der Strategie und die damit verbundenen Vorarbeiten sehr zeitaufwändig sind, dauert dieser Projektteil zurzeit noch an. Zum anderen sollte mittels funktioneller Assays eine TRPS1-abhängige Regulation verschiedener Promotoren gezeigt werden. Hierbei stellte sich heraus, dass diese offenbar ein spezialisiertes Zellsystem mit einem spezifischen Set an Cofaktoren bedarf. Nur in primären Chondrozyten der Maus konnte die Regulation des STAT3-Promotors durch TRPS1 verifiziert werden.
In einem zweiten Teil dieser Arbeit sollte die Regulation des TRPS1-Gens untersucht werden. Mithilfe von Patienten mit einem TRPS und ungeklärter Pathogenese, konnten bislang unbekannte 5’-UTR Exons von TRPS1 identifiziert und mehrere daraus entstehende alternative Transkripte nachgewiesen werden. Ferner konnte per 5’-RACE ein alternativer Transkriptionsstart gefunden werden. Ein 1,7 kb großes Fragment aus der stromaufwärts dieses alternativen Transkriptionsstarts liegenden Region, hat Promotoraktivität in NIH/3T3-Zellen. Dieser alternative TRPS1-Promotor beinhaltet eine putative Bindestelle für den Transkriptionsfaktor Gli3, der von immenser Bedeutung für das Knochenwachstum und die Skelettentwicklung ist. In Kooperation mit dem ZMB Essen wurden vergleichende Analysen der wildtypischen und in der Gli3-Bindestelle mutierten Promotorregion durchgeführt. Durch diese Experimente konnte nachgewiesen werden, dass der alternative TRPS1-Promotor in primären Chondrozyten der Maus über diese Bindestelle stillgelegt wird. Sollte sich durch weitere Experimente bestätigen, dass dies tatsächlich über die Bindung von Gli3 passiert, so wäre der erste Faktor identifiziert, der TRPS1 direkt reguliert. Auch wenn sich dies nicht bestätigen sollte, wird die weitere Charakterisierung des Promotorkonstruktes möglicherweise dabei helfen, solche Faktoren zu bestimmen und TRPS1 in die entsprechenden Signalwege einzuordnen. Dies wiederum wird dabei helfen, die molekularen Ursachen der Entstehung der Tricho-Rhino-Phalangealen Syndrome aufzuklären und das phänotypische Spektrum der TRPS zu erweitern.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei neue genetische Aberrationen identifiziert, die zur Ausprägung eines TRPS-Phänotyps führen. Erstere war eine Deletion von stromaufwärts des TRPS1-Gens gelegenen Elementen, die die Expression dieses Gens beeinflusst. Zweitere war eine partielle Duplikation, die den ORF zerreißt und die allelische Transkriptmenge reduziert. In beiden Fällen war schon die Reduktion der Transkriptmenge eines TRPS1-Allels hinreichend für die Ausprägung eines TRPS. Demnach scheint schon eine geringe Dosisveränderung kritisch zu sein. Dies weist darauf hin, dass eine strenge Regulation der TRPS1-regulierten Gene notwendig ist und unterstreicht somit die Wichtigkeit dieses Transkriptionsfaktors für eine normale Entwicklung.The aim of this study was to better understand the effect of the TRPS1 transcription factor and to classify it into complexes and pathways to elucidate the pathogenesis of the associated disease.
The first part of this thesis was the identification and verification of direct target genes of TRPS1 to gain insight into its cellular function. The expected accumulation of target gene promoters in PCR-based controls could not be shown by ChIP. The subsequent high-throughput sequencing (ChIP-Seq) was not performed due to the uncertain yield of the ChIP. However, using functional assays, a TRPS1-dependent regulation of various promoters was tested. It appears to require a specialized cell system with a specific set of cofactors, as STAT3 promoter regulation by TRPS1 could only be verified in primary mouse chondrocytes.
In the second part of this thesis, the regulation of the TRPS1 gene itself was examined. Using TRPS patients with unexplained pathogenesis, previously unknown 5'-UTR exons and several resulting alternative transcripts of TRPS1 have been identified. Furthermore, an alternative transcription start site has been found by 5' RACE. A 1.7 kb fragment lying upstream from this alternative transcription start site has promoter activity in NIH/3T3 cells. This alternative TRPS1 promoter contains a putative binding site for the Gli3 transcription factor, which is immensely important for bone growth and skeletal development. In cooperation with the ZMB Essen, comparative analyses of the wild type promoter region and a promoter region mutated in the Gli3 binding site demonstrated that the Gli3 binding site silences the alternative TRPS1 promoter in primary mouse chondrocytes. If further experiments confirm that this effect is actually mediated by Gli3-binding, this would verify Gli3 as the first known factor that directly regulates TRPS1. Further characterization of the alternative promoter construct may also help to identify other such factors and to integrate TRPS1 into the relevant signaling pathways. This will help to elucidate the molecular causes of the onset of tricho-rhino-phalangeal syndromes and to expand the phenotypic spectrum of TRPS.
In this thesis, two new genetic aberrations were identified, which lead to the development of a TRPS phenotype. The first is a deletion of elements located upstream of TRPS1 affecting its expression. The second is a partial duplication, which alters the TRPS1 open reading frame and decreases the amount of allelic transcript. In both cases, the reduction of allelic transcription was sufficient for the development of TRPS. Thus, even small changes in TRPS1 gene dosage seem to be critical. This indicates that a strict regulation of TRPS1-regulated genes is essential for normal development, underscoring the importance of this transcription factor
High mutation detection rates in cerebral cavernous malformation upon stringent inclusion criteria: one-third of probands are minors.
Cerebral cavernous malformations (CCM) are prevalent vascular malformations occurring in familial autosomal dominantly inherited or isolated forms. Once CCM are diagnosed by magnetic resonance imaging, the indication for genetic testing requires either a positive family history of cavernous lesions or clinical symptoms such as chronic headaches, epilepsy, neurological deficits, and hemorrhagic stroke or the occurrence of multiple lesions in an isolated case. Following these inclusion criteria, the mutation detection rates in a consecutive series of 105 probands were 87% for familial and 57% for isolated cases. Thirty-one novel mutations were identified with a slight shift towards proportionally more CCM3 mutations carriers than previously published (CCM1: 60%, CCM2: 18%, CCM3: 22%). In-frame deletions and exonic missense variants requiring functional analyses to establish their pathogenicity were rare: An in-frame deletion within the C-terminal FERM domain of CCM1 resulted in decreased protein expression and impaired binding to the transmembrane protein heart of glass (HEG1). Notably, 20% of index cases carrying a CCM mutation were below age 10 and 33% below age 18 when referred for genetic testing. Since fulminant disease courses during the first years of life were observed in CCM1 and CCM3 mutation carriers, predictive testing of minor siblings became an issue.peerReviewe