Asymmetrische Segregation von nukleolären Proteinen in der Mitose von S.cerevisiae

Der Nukleolus der Bäckerhefe ist ein Subkompartiment des Zellkerns, welches um die ribosomale DNA auf Chromosom XII assembliert. Neben ribosomaler DNA und RNA beinhaltet der Nukleolus eine Vielzahl an Proteinen, welche für Transkription ribosomaler Gene, Prozessierung der Primärtranskripte und auch Zellzyklusregulation von Bedeutung sind (Taddei und Gasser, 2012; Pederson, 2011). Ribosomale DNA wird in der Mitose symmetrisch auf Mutter und Tochter verteilt, der umgebende Zellkern hingegen wird asymmetrisch verteilt (Enserink und Kolodner, 2010; Jorgensen et al., 2007). Daher ergibt sich die Frage, welches Verhalten nukleoläre Proteine in der Mitose zeigen. Das Ziel dieser Arbeit war, einen tieferen Einblick in das mitotische Segregationsverhalten nukleolärer Proteine zu erhalten. Hierfür wurden endogene GFP-Fusionen von verschiedenen nukleolären Proteinen durch konfokale Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Es konnte festgestellt werden, dass nukleoläre Proteine in der Mitose drei verschiedene Segregationsmuster vorweisen. Von der RNA Polymerase I Untereinheit Rpa135, den Prozessierungsfaktoren Nop56 und Nsr1, sowie der RENT-Komponente Net1 erhielt der Nukleolus der Mutter im Zuge der mitotischen Segregation einen höheren Proteinanteil als der Nukleolus der Tochter. Die Verteilung dieser Proteine entsprach somit der des nukleoplasmatischen Proteins mCherry-NLS. Das rDNA bindende Protein Fob1 hingegen zeigte eine gleichmäßige Verteilung auf Mutter und Tochter, was ebenso für das stabil an DNA bindende Kernhiston Hta2 zutraf. Das rDNA-Bindeprotein Hmo1 wiederum, welches mit transkribierten Regionen der rDNA assoziiert, zeigte ein besonderes Verteilungsverhalten in der Mitose. Von diesem Protein erhielt der Nukleolus der Tochter den höheren Anteil und damit zeigte Hmo1 eine der Kernsegregation und den meisten anderen nukleolären Proteinen genau gegenläufige Asymmetrie. Als grundlegender Punkt musste getestet werden, ob die asymmetrische Kernteilung einen entscheidenden Einfluss auf die Segregation nukleolärer Proteine nimmt. Sowohl Rpa135 als auch Hmo1 zeigten bei Bleichexperimenten effiziente nukleoläre Retention während der Anaphase. Zudem wurde in einer Δrpa12 Mutante ein gegenläufiger Effekt auf die Segregation nukleolärer Proteine und Nukleoplasma beobachtet. Nach diesen Ergebnissen sollte die Art der Assoziation eines nukleolären Proteins mit rDNA entscheidend für das Segregationsverhalten sein. Des Weiteren scheint Transkription durch RNA Polymerase I während der Anaphase in S.cerevisiae stattzufinden und die mitotische Segregation von nukleolären Proteinen zu beeinflussen. Da die Chromosomentrennung in der Bäckerhefe deutlich asymmetrisch verläuft und eine spezielle Mechanik aufweist (Renshaw et al., 2010), wurde vermutet, dass dies der ausschlaggebende Faktor sein könnte. Bestätigt wurde dies durch in den Mutanten cdc14-3 und Δcin8 gemachte Beobachtungen. Hier konnte eine deutlich veränderte Trennungsmechanik ausgemacht werden und die Proteine Rpa135 und Hmo1 wurden wesentlich symmetrischer verteilt. Geometrie und Mechanik der Chromosomentrennung sollten also die mitotische Segregation nukleolärer Proteine bestimmen. Zudem konnte durch diese Experimente ausgeschlossen werden, dass der Knospenhals als mögliche Barriere die mitotische Segregation nukleolärer Proteine beeinflusst. Das Zurückbleiben von Rpa135, Nop56 und Nsr1 im Nukleolus der Mutter kann durch effiziente nukleoläre Retention der Proteine in Verbindung mit dynamischer rDNA-Assoziation und der asymmetrischen Chromosomentrennung erklärt werden. Gleichverteilung wie im Falle von Fob1 sollte durch stabile DNA-Bindung zustande kommen. Das besondere Verhalten von Hmo1 allerdings kann mit diesen Argumenten nicht erklärt werden, weshalb Struktur-Funktionsanalysen für Hmo1 durchgeführt wurden. Hierbei wurden verschiedene Derivate von Hmo1 hinsichtlich subzellulärer Lokalisation und Nukleinsäurebindung mittels EMSA-Studien charakterisiert. rDNA-Bindung stellte sich als grundlegend, jedoch nicht hinreichend für normale Lokalisation und Segregation heraus. Zudem stellte Oligomerisierung eine Grundvoraussetzung dar. Des Weiteren zeigte Hmo1 in Situationen niedriger transkriptioneller Aktivität eine massive nukleoläre Anreicherung, welche ebenso von Oligomerisierung abhängig war und die Aktivität von RNA Polymerase I war notwendig für die Etablierung der Asymmetrie von Hmo1. Daher wird vermutet, dass das besondere Segregations-verhalten von Hmo1 durch seine intrinsischen Eigenschaften im Zusammenhang mit einer durch RNA Polymerase I verursachten Verdrängung zustande kommt. Während der Anaphase wird ein Schwesterchromatid aus dem Nukleolus der Mutter gezogen, wobei speziell das für die Tochter bestimmte Chromatid starke Streckungs- und Kompaktierungsereignisse durchläuft. Dadurch wird dieses vermutlich deshalb von RNA Polymerase I depletiert, da das Enzym dynamisch mit rDNA wechselwirkt und somit im Nukleolus der Mutter zurückgehalten wird. Innerhalb einer elongierten Anaphasestruktur könnte dann eine Verschiebung von Hmo1 in die töchterlichen Bereiche erfolgen, welche von Polymerase depletiert sind. Hier könnte Hmo1 durch rDNA-Bindung und Oligomerisierung massiv anreichern. Vermutlich werden durch Geometrie und Mechanik der rDNA-Trennung unterschiedliche rDNA-Chromatinzustände etabliert. Der Mutternukleolus verfügt nach der Trennung über eine höhere Menge an RNA Polymerase I und Prozessierungsfaktoren als der Tochternukleolus und befindet sich vermutlich in einem transkriptionell hochaktiven Zustand. Der Tochternukleolus hingegen verfügt über eine höhere Menge an Hmo1 und befindet sich vermutlich in einem transkriptionell weniger aktiven Zustand

Adipose tissue depot specific expression and regulation of fibrosis-related genes and proteins in experimental obesity

Transforming growth factor beta (Tgfb) is a well-studied pro-fibrotic cytokine, which upregulates cellular communication network factor 2 (Ccn2), collagen, and actin alpha 2, smooth muscle (Acta2) expression. Obesity induces adipose tissue fibrosis, which contributes to metabolic diseases. This work aimed to analyze the expression of Tgfb, Ccn2, collagen1a1 (Col1a1), Acta2 and BMP and activin membrane-bound inhibitor (Bambi), which is a negative regulator of Tgfb signaling, in different adipose tissue depots of mice fed a standard chow, mice fed a high fat diet (HFD) and ob/ob mice. Principally, these genes were low expressed in brown adipose tissues and this difference was less evident for the ob/ob mice. Ccn2 and Bambi protein as well as mRNA expression, and collagen1a1 mRNA were not induced in the adipose tissues upon HFD feeding whereas Tgfb and Acta2 mRNA increased in the white fat depots. Immunoblot analysis showed that Acta2 protein was higher in subcutaneous and perirenal fat of these mice. In the ob/ob mice, Ccn2 mRNA and Ccn2 protein were upregulated in the fat depots. Here, Tgfb, Acta2 and Col1a1 mRNA levels and serum Tgfb protein were increased. Acta2 protein was, however, not higher in subcutaneous and perirenal fat of these mice. Col6a1 mRNA was shown before to be higher in obese fat tissues. Current analysis proved the Col6a1 protein was induced in subcutaneous fat of HFD fed mice. Notably, Col6a1 was reduced in perirenal fat of ob/ob mice in comparison to the respective controls. 3T3-L1 cells express Ccn2 and Bambi protein, whose levels were not changed by fatty acids, leptin, lipopolysaccharide, tumor necrosis factor and interleukin-6. All of these factors led to higher Tgfb in 3T3-L1 adipocyte media but did not increase its mRNA levels. Free fatty acids induced necrosis whereas apoptosis did not occur in any of the in vitro incubations excluding cell death as a main reason for higher Tgfb in cell media. In summary, Tgfb mRNA is consistently induced in white fat tissues in obesity but this is not paralleled by a clear increase of its target genes. Moreover, discrepancies between mRNA and protein expression of Acta2 were observed. Adipocytes seemingly do not contribute to higher Tgfb mRNA levels in obesity. These cells release more Tgfb protein when challenged with obesity-related metabolites connecting metabolic dysfunction and fibrosis

Compositional reorganization of the nucleolus in budding yeast mitosis

The nucleolus is a membraneless organelle of the nucleus and the site of rRNA synthesis, maturation, and assembly into preribosomal particles. The nucleolus, organized around arrays of rRNA genes (rDNA), dissolves during prophase of mitosis in metazoans, when rDNA transcription ceases, and reforms in telophase, when rDNA transcription resumes. No such dissolution and reformation cycle exists in budding yeast, and the precise course of nucleolar segregation remains unclear. By quantitative live-cell imaging, we observed that the yeast nucleolus is reorganized in its protein composition during mitosis. Daughter cells received equal shares of preinitiation factors, which bind the RNA polymerase I promoter and the rDNA binding barrier protein Fob1, but only about one-third of RNA polymerase I and the processing factors Nop56 and Nsr1. The distribution bias was diminished in nonpolar chromosome segregation events observable in dyn1 mutants. Unequal distribution, however, was enhanced by defects in RNA polymerase I, suggesting that rDNA transcription supports nucleolar segregation. Indeed, quantification of pre-rRNA levels indicated ongoing rDNA transcription in yeast mitosis. These data, together with photobleaching experiments to measure nucleolar protein dynamics in anaphase, consolidate a model that explains the differential partitioning of nucleolar components in budding yeast mitosis

Analysis of Outcomes in Ischemic vs Nonischemic Cardiomyopathy in Patients With Atrial Fibrillation A Report From the GARFIELD-AF Registry

IMPORTANCE Congestive heart failure (CHF) is commonly associated with nonvalvular atrial fibrillation (AF), and their combination may affect treatment strategies and outcomes