Human epididymis protein 4 reference limits and natural variation in a Nordic reference population

The objectives of this study are to establish reference limits for human epididymis protein 4, HE4, and investigate factors influencing HE4 levels in healthy subjects. HE4 was measured in 1,591 samples from the Nordic Reference Interval Project Bio-bank and Database biobank, using the manual HE4 EIA (Fujirebio) for 802 samples and the Architect HE4 (Abbott) for 792 samples. Reference limits were calculated using the statistical software R. The influence of donor characteristics such as age, sex, body mass index, smoking habits, and creatinine on HE4 levels was investigated using a multivariate model. The study showed that age is the main determinant of HE4 in healthy subjects, corresponding to 2% higher HE4 levels at 30 years (compared to 20 years), 9% at 40 years, 20% at 50 years, 37% at 60 years, 63% at 70 years, and 101% at 80 years. HE4 levels are 29% higher in smokers than in nonsmokers. In conclusion, HE4 levels in healthy subjects are associated with age and smoking status. Age-dependent reference limits are suggested

Treatment of ocular allergies:nonpharmacologic, pharmacologic and immunotherapy

Ocular allergy is a significant and growing issue worldwide but for many patients, it is often not differentiated from systemic conditions, such as hay fever. Management of seasonal and perennial allergic conjunctivitis is often poor. Management is principally through avoidance measures (blocking or hygiene), nonpharmaceutical (such as artificial tears and cold compresses) and pharmaceutical (such as topical antihistamines and prophylactic mast cell stabilizers). Vernal and atopic keratoconjunctivitis are more severe and generally need treatment with NSAIDs, steroids and immunomodulators. Giant papillary conjunctivitis can be related to allergy but also is often contact lens related and in such cases can be managed by a period of abstinence and replacement of the lens or a change in lens material and/or design. Immunotherapy can be efficacious in severe, persistent cases of contact lens or allergic conjunctivitis

Implementation of a comprehensive severe weather/tornado emergency action plan for the University of Wisconsin-Stout

Includes bibliographical references

generation and characterisation of recombinante human cytomegaloviruses harbouring mutations of the UAP56- and/or RNA interaction domains of the RNA export factor pUL69

Hintergrund und Ziele Herpesviren und andere Viren, die im Zellkern replizieren, greifen für den Export ihrer mRNAs auf zelluläre und/oder eigene Transportfaktoren zurück. Als solche herpesviralen RNA-Exportfaktoren konnten die Regulatorproteine der ICP27-Familie identifiziert werden, zu denen auch das UL69-Protein des humanen Cytomegalovirus (HCMV) gehört. Die Proteine dieser Familie besitzen als virale RNA-Exportfaktoren charakteristische Eigenschaften: sie wandern zwischen Zellkern und Zytoplasma (Shuttle-Aktivität), sie binden direkt an RNA und exportieren diese durch Interaktion mit zellulären mRNA-Exportfaktoren aus dem Nukleus. Für das UL69-Protein konnte durch in vitro Analysen gezeigt werden, daß die Interaktion mit dem zellulären mRNA-Exportfaktor UAP56 essenziell ist für den nukleären Export intronloser RNA. Obwohl für UL69 auch eine RNA-Bindungsaktivität detektiert wurde, zeigten RNA-bindungsdefiziente Mutanten keinen Verlust der RNA-Exportaktivität. Das Ziel dieser Arbeit bestand darin, rekombinante Cytomegaloviren zu konstruieren, die Mutationen in der UAP56- sowie der RNA-Bindungsdomäne des UAP56 aufwiesen. Die Charakterisierung dieser Viren sollte Aufschluss darüber geben, inwieweit die bislang durch in vitro-Analysen untersuchten Wechselwirkungen mit UAP56 und RNA auch für die virale Replikation von Bedeutung sind. Methoden Zur Konstruktion rekombinanter Cytomegaloviren wurde ein zweistufiges Verfahren verwendet, das auf homologer Rekombination BAC (bacterial artificial chromosome)-klonierter viraler DNA in E. coli beruht. In einem ersten Schritt wurde das UL69-Gen durch den Selektionsmarker Galaktosekinase ersetzt, der sowohl Positiv- als auch Negativ-Selektion ermöglicht. In einem zweiten Schritt erfolgte die Insertion mutierter UL69-Sequenzen. Zur Verifizierung der strukturellen Integrität der rekombinanten BACs wurden diese durch PCR, Restriktionsenzym-Verdau und Southern Blot-Analysen charakterisiert. Die Rekonstitution rekombinanter Cytomegaloviren erfolgte durch Transfektion von primären humanen Fibroblasten mit gereinigter BAC-DNA. Replikationskinetiken wurden sowohl durch Quantifizierung der viralen DNA durch Taqman-PCR als auch der infektiösen Viren im Zellkulturüberstand erstellt. Durch Western Blot-Analysen wurde die Proteinexpressionskinetik rekombinanter Viren charakterisiert. Ergebnisse Durch homologe Rekombination in E.coli konnten die Genome rekombinanter Cytomegaloviren mit Deletion bzw. Punktmutationen des Leserahmens UL69 konstruiert werden (UL69WT, UL69-galK, UL69mUAP, UL69∆R1∆RS, UL69∆R2∆RS, bzw. UL69Rev). Die Integrität der viralen Genome sowie die korrekte Insertion der gewünschten Mutationen wurde durch PCR, Restriktionsenzym- und Nukleotidsequenzanalysen sowie durch Southern Blot bestätigt. Nach Transfektion gereinigter BAC-DNA gelang es in allen Fällen rekombinante Viren zu rekonstituieren. Dies weist darauf hin, daß sowohl UL69 insgesamt als auch die mutierten Domänen (UAP56-Bindungsstelle, RNA-Bindedomäne) nicht essenziell sind für die virale Replikation. Wachstumskurven zeigten jedoch, dass die Mutanten AD169-UL69mUAP und AD169-UL69∆R1∆RS, welche eine punktmutierte bzw. deletierte UAP56-Bindestelle des UL69 enthielten, eine deutlich verzögerte Replikation im Vergleich zu Wildtypviren aufwiesen. Interessanterweise konnte auch für die Mutante AD169-UL69∆R2∆RS (Mutation der RNA-Bindungsdomäne des UL69) eine verzögerte Replikation beobachtet werden. Dies zeigt, daß die UL69 RNA-Bindung in vivo relevant ist für effiziente virale Vermehrung. Eine vergleichende Analyse der Freisetzung infektiöser Viruspartikel und viraler DNA im Zellkulturüberstand ergab eine gute Korrelation, so daß die Deletion bzw. Mutation von UL69 keinen Einfluß auf die Stabilität infektiöser Viruspartikel hat. Zur weiteren Charakterisierung der rekombinanten Viren wurde durch Western Blot-Analysen die Kinetik der viralen Proteinexpression untersucht. Dabei wurde deutlich, dass die Deletion von UL69 bzw. die Mutation der UAP56-Bindungsstelle insbesondere die Expression der späten viralen Proteine beeinflusst. Praktische Schlußfolgerungen Zusammenfassend gelang es mit dieser Arbeit mittels BAC-Rekombination humane Cytomegaloviren mit Mutation in der UAP56- und/oder RNA-Interaktionsdomäne des RNA-Exportfaktors pUL69 zu konstruieren. Diese Viren zeigten im Vergleich zu Wildtypviren ein verzögertes Replikationsverhalten, so daß beide Proteindomänen funktionelle Relevanz während der viralen Replikation aufweisen. Durch die Konstruktion dieser Viren konnte eine wichtige Voraussetzung geschaffen werden, um durch weitere detaillierte Charakterisierung zu klären, welche viralen Gene auf Ebene der Transkription oder auf mRNA-Exportebene durch pUL69 reguliert werden.Setting and targets Herpesviruses as well as other viruses that replicate within the nucleus have to make use of cellular and/or viral regulatory factors in order to facilitate the export of their mRNAs. The ICP27 protein family which includes the protein UL69 of human cytomegalovirus (HCMV), has been shown to encode herpesviral RNA export factors. All characterized members of this protein family exhibit characteristic features of RNA export factors: they shuttle between the nucleus and the cytoplasm, they directly interact with RNA and mediate its nuclear export via interaction with components of the cellular mRNA export machinery. In vitro analyses could demonstrate that a direct interaction of pUL69 with the cellular mRNA export factor UAP56 is essential for its stimulating effects on the nuclear export of intronless RNAs. Although RNA-binding could be detected for pUL69, an RNA binding deficient mutant did not lack its RNA export activity. Thus, the major goal of this work was to generate recombinant HCMVs carrying a mutated UAP56-binding domain and/or a deleted RNA-binding domain of UL69. The characterization of these recombinant viruses should clarify the role of UAP56 and RNA interaction of pUL69 for viral replication. Methods To construct rekombinant HCMVs a two-step selection procedure was applied that was based on homologous recombination of BAC (bacterial artificial chromosome)-cloned viral DNA in E. coli. In a first step, the UL69 gene was replaced by the selection marker galaktokinase which could be used for both positive and negative selection. In a second step the mutated/recombinant UL69 sequences were inserted. To verify the structural integrity of the recombinant BACs, PCR, endonuclease restriction digestion and Southern Blot analyses were performed. The reconstitution of recombinant HCMVs could be obtained by transfection of primary human fibroblasts with purified BAC DNA. Replication kinetics were analyzed by the quantification of viral DNA via Taqman-PCR as well as by titration of infectious virus in cell culture supernatants. Protein expression kinetics of recombinant HCMVs were characterized by Western Blot analyses. Results Recombinant HCMVs with deletions and point mutations of the open reading frame UL69 (UL69WT, UL69-galK, UL69mUAP, UL69∆R1∆RS, UL69∆R2∆RS, UL69Rev) were constructed via homologous recombination in E. coli. The integrity of the viral genome as well as the correct insertion of the intended mutations were verified by PCR, restriction enzyme digestion, nucleotide sequencing and Southern Blot analyses. After transfection of purified BAC-DNA recombinant HCMVs could be reconstituted for each UL69 BAC. This suggested that UL69 itself as well its mutated domains (UAP56-binding, RNA-binding domain) are not essential for viral replication. However, growth curve analyses demonstrated that the mutants AD169-UL69mUAP and AD169-UL69∆R1∆RS comprising a point-mutated or deleted UAP56-binding domain of UL69 showed a significantly reduced replication in contrast to wildtype virus. Surprisingly, a reduced replication could also be observed for the mutant AD169-UL69∆R2∆RS (mutated RNA-binding domain of UL69). This demonstrates that UL69 RNA-binding is a prerequisite for efficient viral replication in vivo. A comparative analysis revealed a good correlation of viral particle release and of viral DNA in supernatants of infected cells. This excludes a major effect of mutated forms of pUL69 on the stability of viral particles. Western blot analyses of protein expression after infection with genuine or mutated HCMVs revealed that a deletion of UL69 or a mutated UAP56-binding had a major effect on the expression of late viral proteins. Conclusion In summary, recombinant HCMVs harbouring mutations of the UAP56- and/or RNA interaction domains of the RNA export factor pUL69 could be constructed via BAC-recombination. Compared to wildtype HCMV, these recombinant viruses showed a reduced replication indicating a functional relevance of the respective protein domains for effective viral replication. The construction of these recombinant HCMVs is an important prerequisite to further characterize which viral genes are regulated by pUL69 on the level of transcription or mRNA export

An illustrated synopsis of the principal larval forms of the order Coleoptera,

"Reprinted from Entomologica Americana, vol. IX, (new series)"Descriptive letterpress on versos facing the plates."Literature": p. 69.Mode of access: Internet