DETECTION OF CALR MUTATIONS USING HIGH RESOLUTION MELTING CURVE ANALYSIS (HRM-A); APPLICATION ON A LARGE COHORT OF GREEK ET AND MF PATIENTS

Background and Objectives Somatic mutations in the calreticulin gene (CALR) are detected in approximately 70% of patients with essential thrombocythemia (ET) and primary or secondary myelofibosis (MF), lacking the JAK2and MPLmutations. To determine the prevalence of CALRframeshift mutations in a population of MPN patients of Greek origin, we developed a rapid low-budget PCR-based assay and screened samples from 5 tertiary Haematology units. This is a first of its kind report of the Greek patient population that also disclosed novel CALRmutants.   Methods MPN patient samples were collected from different clinical units and screened for JAK2and MPLmutations after informed consent was obtained. Negative samples were analyzed for the presence of CALRmutations. To this end, we developed a modified post Real Time PCR High Resolution Melting Curve analysis (HRM-A) protocol. Samples were subsequently confirmed by Sanger sequencing.   Results Using this protocol we screened 173 MPN, JAK2and MPLmutation negative, patients of Greek origin, of whom 117 (67.63%) displayed a CALRexon 9 mutation. More specifically, mutations were detected in 90 out of 130 (69.23%) essential thrombocythaemia cases (ET), in 18 out of 33 (54.55%) primary myelofibrosis patients (pMF) and in 9 out of 10 (90%) cases of myelofibrosis secondary to ET (post-ET sMF). False positive results were not detected. The limit of detection (LoD) of our protocol was 2%. Furthermore, our study reavealed 6 rare novel mutations which are to be added in the COSMIC database.    Conclusions Overall, our method could rapidly and cost-effectively detect the mutation status in a representative cohort of Greek patients; the mutation make-up in our group was not different from what has been published for other national groups

Genetic polymporphisms and pregnancy outcome

Background: Recent findings show that a number of single nucleotide polymorphisms (SNPs) within the promoter region of the annexin A5-gene (ANXA5) reduce the expression of the reporter gene and so they display a significant association with recurrent pregnancy loss (RPL). Objective: The objective of the present study aimed to address the contribution of ANXA5 M2 haplotype consisting of four minor alleles: (SNP1: (-)467G>A, SNP2: (-)448A>C, SNP3: (-)422T>C and SNP4:(-)373G>A) in the occurrence of recurrent pregnancy losses in the Greek population, and the role of further two minor alleles: SNP5:(-)302 T>G and SNP6: (-)1C>T as independent risk factors for RPL. Methods: A 752bp genomic region of ANXA5 promoter was amplified by PCR using specific primers. Genotypic analysis by Sanger sequencing was performed for these six SNPs (minor alleles) in the promoter region of ANXA5 gene,in one hundred (100) Greek women with recurrent miscarriages (median=3) and seventy (70) fertile controls.Statistical analysis was done using the SAS 9.3 for Windows (SAS Institute Inc. NC, USA) and SPSS packages for Windows (C.DiMaggio 2013, SAS Institute 2014).Results: This case-control study revealed that there is not any significantly increased risk of RPL among the M2/ANXA5 haplotype carriers in the Greek population, as there were no statistical differences between the patients with recurrent pregnancy losses and the fertile controls (11.5% in RPL cases vs 9.29% in controls, p-value: 0.6364). There was no difference in SNP5 and SNP6 minor carriership between the two groups. In particular, carriers of SNP5 and SNP6 had an increased risk for RPL state with odds ratio: 1.2472 and 1.3846 respectively, however without statistically significant importance. Conclusion: The M2/ANXA5 haplotype does not differ between RPL patients and controls in the Greek population. Also, it is the first time that SNP5 and SNP6 minor alleles were evaluated extensively in women of European origin with recurrent pregnancy losses (RPL), and they do not seem to be independent risk factors in the occurrence of RPL in the Greek population. Though, this has to be confirmed in further and larger clinical trials with women of European origin.Εισαγωγή: Πρόσφατα ευρήματα δείχνουν ότι ένας αριθμός μονών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) εντός της περιοχής του υποκινητή του γονιδίου αννεξίνης-Α5 (ΑΝΧΑ5) μειώνει την έκφραση του γονιδίου αναφοράς και έτσι αυτά παρουσιάζουν σημαντική συσχέτιση με την ύπαρξη επαναλαμβανόμενων απωλειών εγκυμοσύνης (RPL).Σκοπός: Στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να μελετηθεί η συσχέτιση του απλοτύπου M2/ ANXA5 που αποτελείται από τέσσερα υπολειπόμενα αλληλόμορφα: [(SNP1: (-) 467G> A, SNP2: (-) 448A> C, SNP3: (-) 422T> C και SNP4: (-) 373G> A)] με την εμφάνιση επαναλαμβανόμενων απωλειών εγκυμοσύνης στον ελληνικό πληθυσμό, καθώς και των υπολειπόμενων αλληλόμορφων δύο περαιτέρω πολυμορφισμών (SNPs): του SNP5: (-) 302T> G και του SNP6: (-) 1C> T, ως ανεξάρτητων παραγόντων κινδύνου για RPL.Μέθοδοι: Μια γονιδιωματική περιοχή 752bp του υποκινητή του ANXA5 γονιδίου ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές. Για τα έξι αυτά SNPs (υπολειπόμενα αλλήλια) στην περιοχή του υποκινητή γονιδίου της ANXA5, έγινε γονοτυπική ανάλυση με Sanger ακολουθία σε εκατό (100) Ελληνίδες γυναίκες με επαναλαμβανόμενες αποβολές (διάμεση τιμή = 3) και εβδομήντα (70) γόνιμες γυναίκες. Η στατιστική ανάλυση έγινε χρησιμοποιώντας το SAS 9.3 για τα Windows (SAS Institute Inc. NC, ΗΠΑ) και τα πακέτα SPSS για Windows (C.DiMaggio 2013, SAS Institute 2014).Αποτελέσματα: Αυτή η μελέτη ελέγχου αποκάλυψε ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντικά αυξημένος κίνδυνος εμφάνισης καθ’έξιν αποβολών (RPL) μεταξύ των φορέων του M2 / ANXA5 (υπολειπόμενα αλληλόμορφα των SNP1-4) στον ελληνικό πληθυσμό, καθώς δεν υπήρχαν στατιστικές διαφορές μεταξύ των ασθενών με επαναλαμβανόμενες απώλειες εγκυμοσύνης και των γόνιμων μαρτύρων (11,5% στο RPL περιπτώσεις έναντι 9,29% στους μάρτυρες, ρ-τιμή: 0,6364). Δεν υπήρχε στατιστικά σημαντική διαφορά όσο αφορά τον ανεξαρτητο προγνωστικό παράγοντα κινδύνου για τα SNP5 και SNP6 μεταξύ των δύο ομάδων. Συγκεκριμένα, οι φορείς των SNP5 και SNP6 είχαν αυξημένο κίνδυνο για εμφάνισηκαθ’έξιν αποβολών (RPL) με αναλογία πιθανοτήτων: 1,2472 και 1,3846 αντίστοιχα, αλλά χωρίς στατιστικά σημαντική σημασία.Συμπεράσματα:Ο απλότυπος M2 / ANXA5 δεν διαφέρει όσο αφορά το μέγεθος κινδύνου μεταξύ των ασθενών με RPL και των γόνιμων γυναικών στον ελληνικό πληθυσμό. Επίσης, είναι η πρώτη φορά που τα υπολειπόμενα αλλήλια των SNP5 και SNP6 αξιολογήθηκαν εκτενώς σε γυναίκες ευρωπαϊκής προέλευσης με επαναλαμβανόμενες απώλειες εγκυμοσύνης (RPL) και δεν φαίνεται να αποτελούν ανεξάρτητους παράγοντες κινδύνου στην εμφάνιση RPL στον ελληνικό πληθυσμό. Ωστόσο, αυτό πρέπει να επιβεβαιωθεί σε περαιτέρω και μεγαλύτερες κλινικές δοκιμές σε γυναίκες ευρωπαϊκής προέλευσης