Uso de metales de transición en ensayos combinatorios metal-antibiótico para la resensibilización de bacterias resistentes

Desde que comenzó la producción en masa de los antibióticos se logró combatir de mejor manera las infecciones bacterianas, pero con este desarrollo tecnológico creció también la probabilidad de la aparición de cepas resistentes a estos fármacos. Recientemente se ha investigado más en esta área debido a que cada vez son más las zonas geográficas afectadas, así como la variedad de los microorganismos resistentes. Una de las estrategias para combatir este problema es reintroducir los antibióticos que previa y actualmente se encuentran en uso al combinarlos con agentes sensibilizantes, los cuales permitirían vencer la resistencia a antibióticos. En el presente trabajo se utilizan combinaciones de metales de transición con antibióticos, siendo estos metales Cu(II), Cd(II), Co(II), Ni(II) y Zn(II), para estudiar si son capaces de sensibilizar a cultivos de Escherichia coli o Staphylococcus aureus a los antibióticos utilizados, y posteriormente probar si poseen la capacidad para resensibilizar cepas de estos microorganismos resistente a un antibiótico específico. Mediante la determinación de concentraciones mínimas inhibitorias se seleccionaron las concentraciones a probar, y se realizaron combinaciones metalantibiótico siguiendo la metodología checkerboard. Se realizaron pruebas de inhibición en una cepa de Escherichia coli ATCC 11229, observando que es posible utilizar Cu(II), Co(II), Cd(II) y Ni(II) para inhibir esta cepa en combinación con ampicilina, mientras que Cu(II), Zn(II), Co(II) y Cd(II) se pueden utilizar para causar este efecto con kanamicina. Siguiendo la misma metodología con la cepa de Staphylococcus aureus ATCC 6538 se observó que es posible utilizar Ni(II) para inhibir el cultivo en combinación con los antibióticos β-lactámicos ampicilina y meticilina, mientras que Cu(II), Zn(II), Co(II) y Cd(II) son capaces de inhibir el crecimiento de la cepa al combinarse con kanamicina. Utilizando los plásmidos pUC57 y pGEX4T2 se transformaron las cepas para conferirles resistencia a los antibióticos utilizados, sometiéndolas a las mismas pruebas que aquellas sensibles. En E. coli se observó que Cu(II), Cd(II) y Ni(II) poseen la capacidad de re-sensibilizar a la cepa resistente a ampicilina, mientras que Cu(II) Zn(II) y Cd(II) son capaces de causar este efecto la cepa resistente a kanamicina. Cu(II), Zn(II) y Cd(II) lograron re-sensibilizar S. aureus resistente a kanamicina, mientras que no se logró una re-sensibilización en las cepas resistentes a los antibióticos β-lactámicos utilizados. Una búsqueda bibliográfica nos encaminó a plantear la utilización de combinaciones metal-antibiótico aquí presentadas en materiales de uso tópico como posible aplicación terapéutica como estrategia para combatir las problemáticas de infecciones bacterianas resistentes y no resistentes, debido a que las concentraciones que se utilizan en el presente trabajo se encuentran por debajo de las reportadas como dañinas por esta vía. Por último se puede concluir que utilizar los metales de transición Cu(II), Zn(II), Co(II), Cd(II) y Ni(II) para sensibilizar bacterias a antibióticos, así como para disminuir la capacidad de crecimiento de las bacterias resistentes a los mismos presenta ser un área de oportunidad para combatir la problemática relacionada con las enfermedades infecciosas persistentes por este tipo de bacterias

Uso del exopolisacárido de Rhodotorula mucilaginosa UANL-001L como agente estabilizador en la síntesis de nanopartículas metálicas para la obtención de compuestos híbridos con actividad antimicrobiana y antibiofilm

El consumo global de los antibióticos ha causado que los microorganismos estén sometidos bajo un estrés selectivo que los obliga a adaptarse a estas nuevas condiciones de vida que contienen altas concentraciones de antibióticos, por lo cual emergen cepas bacterianas con variedad de resistencias a diferentes familias de estos fármacos. Recientemente se ha estudiado el uso de nanopartículas metálicas en esta área, ya que poseen efecto antimicrobiano, tanto contra cepas silvestres como resistentes, que las convierten en candidatos potenciales para su uso como agentes terapéuticos; adicionalmente los exopolisacáridos microbianos se han utilizado en la síntesis de nanopartículas para mejorar su biocompatibilidad, reduciendo así el riesgo de utilizarlos en una variedad de aplicaciones. En el presente trabajo se realizó la síntesis de nanopartículas metálicas, de Cu, Ni y Zn, utilizando el exopolisacárido de la levadura Rhodotorula mucilaginosa UANL-001L, una cepa aislada en la región noreste del estado, como agente estabilizante, así como ácido ascórbico como agente reductor, con el fin de obtener compósitos antimicrobianos que posean la capacidad de inhibir el crecimiento y la producción de biofilm de dos cepas clínicas resistentes a antibióticos aisladas de pacientes internados en un hospital del municipio de Monterrey. Estableciendo un diseño de experimentos 33, que incluía 3 concentraciones a probar de cada componente (sal metálica, exopolisacárido y ácido ascórbico) se logró sintetizar nanopartículas estables de NiO y ZnO, se caracterizaron mediante diferentes técnicas observando los plasmones de resonancia de superficie característicos para estos metales, mediante espectrofotometría infrarroja se observó que las nanopartículas se encuentran en la red polimérica del exopolisacárido utilizado, mediante microscopía electrónica se determinó un tamaño de partícula de 26 y 8 nm para las nanopartículas de Ni y Zn, respectivamente, sintetizadas en la matriz del EPS. Dos cepas bacterianas resistentes a antibióticos, S. aureus y P. aeruginosa, fueron utilizadas para conocer la actividad antimicrobiana de los compósitos obtenidos. Utilizando el compósito que contiene nanopartículas de NiO se logró inhibir tanto el crecimiento como la producción de biofilm de la cepa grampositiva a una concentración de 3 mg/mL, así como a la cepa gramnegativa a una concentración de 2 mg/mL. Mientras que el compósito que contiene las nanopartículas de ZnO solo logró inhibir el crecimiento de la cepa grampositiva a una concentración de 1 mg/mL, siendo incapaz de inhibir el crecimiento de la cepa gramnegativa ni la producción de biofilm de ambas cepas. El compósito que contiene las nanopartículas de NiO fue utilizado en combinación con diferentes antibióticos con el fin de conocer si es capaz de potenciar el efecto de los mismos. Utilizando combinaciones de concentraciones menores a la inhibitoria se observó que este compósito es capaz de potenciar el efecto inhibitorio de los antibióticos ampicilina, kanamicina y cloranfenicol contra la cepa grampositiva, así como el efecto inhibitorio de kanamicina, cloranfenicol y ciprofloxacino contra la cepa gramnegativa. De manera similar se utilizaron combinaciones del compósito y antibióticos para conocer si es capaz de inhibir la producción de biofilm, observando que este efecto inhibitorio es nulo. Con el fin de conocer la posibilidad de utilizar los compósitos para tratamiento de infecciones se determinó la toxicidad in vivo, vía oral, de ambos compósitos, así como del exopolisacárido sin modificar. Se encontró que los tres compuestos a una concentración mayor a las inhibitorias encontradas no posee efecto tóxico, evidenciado por la falta de diferencia significativa en los valores de parámetro renales determinados. En base a los resultados obtenidos se puede concluir que el compósito de exopolisacárido que contiene nanopartículas de NiO es un buen candidato para utilizarse como agente antimicrobiano en el tratamiento de infecciones causadas por Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa al poseer la capacidad de inhibir tanto el crecimiento como la producción de biofilm, así como no presentar toxicidad vía oral en ratas Wistar

Synthesis and characterization of calcium hydroxide obtained from agave bagasse and investigation of its antibacterial activity

ABSTRACT Calcium hydroxide (Ca(OH)2) is recognized as an efficient bactericide and is widely applied as a root canal filler in endodontic treatment. Ca(OH)2 is mainly produced by hydration of calcium oxide (CaO), a product of the thermal decomposition of calcium carbonate (CaCO3) from sources such as limestone. In this work, calcium hydroxide particles were synthetized by the thermochemical transformation of waste biomass from the tequila industry. Agave biomass processed at 600 °C was composed mostly of calcium carbonate (CaCO3), while calcination at 900 °C followed by hydration produced Ca(OH)2. The morphology and crystalline nature of the Ca(OH)2 particles were characterized by micro-Raman spectroscopy, scanning electron microscopy and X-ray diffraction analysis. Bactericidal activity of synthesized calcium hydroxide was evaluated with the agar diffusion assay. Our results provide evidence that Ca(OH)2 obtained from agave biomass is an effective bactericidal against Escherichia coli and Enterococcus faecalis. Biomass from agave is available in Mexico and the rest of the American continent, the use of processed bagasse for medical applications could provide a venue for the useful disposition of industrial waste. Palabras clave: recursos renovables, ceniza, bactericida, Ca(OH)2 RESUMEN El hidróxido de calcio (Ca(OH)2) es reconocido como un eficiente bactericida y es ampliamente utilizado como relleno de la raíz dental en tratamientos de endodoncia. El Ca(OH)2 es producido por la hidratación del óxido de calcio (CaO), un producto de la descomposición térmica del carbonato de calcio (CaCO3), obtenido principalmente de piedra caliza. En el presente trabajo, se sintetizaron partículas de hidróxido de calcio mediante la descomposición térmica de biomasa residual de la industria tequilera. La biomasa de agave se procesó a 600 °C, la cual se compone principalmente de carbonato de calcio (CaCO3), por lo que su calcinación a 900 °C y posterior hidratación producen el Ca(OH)2. La morfología y cristalinidad de las partículas de Ca(OH)2 se caracterizaron mediante el uso de espectroscopía Raman, microscopio electrónico de barrido y difracción de rayos X. La actividad bactericida del hidróxido de calcio obtenido, se evaluó mediante el ensayo de difusión en agar. Los resultados proveen evidencia de la efectividad del Ca(OH)2, obtenido de la biomasa de agave, contra Escherichia coli y Enterococcus faecalis. La biomasa de agave se encuentra ampliamente disponible en México y el resto del continente americano, por lo que el uso de bagazo de agave procesado en aplicaciones médicas, puede proveer una alternativa en la disposición y el uso de residuos agroindustriales

Synthetic Biology Tools for Engineering Microbial Cells to Fight Superbugs

With the increase in clinical cases of bacterial infections with multiple antibiotic resistance, the world has entered a health crisis. Overuse, inappropriate prescribing, and lack of innovation of antibiotics have contributed to the surge of microorganisms that can overcome traditional antimicrobial treatments. In 2017, the World Health Organization published a list of pathogenic bacteria, including Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, and Escherichia coli (ESKAPE). These bacteria can adapt to multiple antibiotics and transfer their resistance to other organisms; therefore, studies to find new therapeutic strategies are needed. One of these strategies is synthetic biology geared toward developing new antimicrobial therapies. Synthetic biology is founded on a solid and well-established theoretical framework that provides tools for conceptualizing, designing, and constructing synthetic biological systems. Recent developments in synthetic biology provide tools for engineering synthetic control systems in microbial cells. Applying protein engineering, DNA synthesis, and in silico design allows building metabolic pathways and biological circuits to control cellular behavior. Thus, synthetic biology advances have permitted the construction of communication systems between microorganisms where exogenous molecules can control specific population behaviors, induce intracellular signaling, and establish co-dependent networks of microorganisms

Synergistic Antimicrobial Effects of Silver/Transition-metal Combinatorial Treatments

Due to the emergence of multi-drug resistant strains, development of novel antibiotics has become a critical issue. One promising approach is the use of transition metals, since they exhibit rapid and significant toxicity, at low concentrations, in prokaryotic cells. Nevertheless, one main drawback of transition metals is their toxicity in eukaryotic cells. Here, we show that the barriers to use them as therapeutic agents could be mitigated by combining them with silver. We demonstrate that synergism of combinatorial treatments (Silver/transition metals, including Zn, Co, Cd, Ni, and Cu) increases up to 8-fold their antimicrobial effect, when compared to their individual effects, against E. coli and B. subtilis. We find that most combinatorial treatments exhibit synergistic antimicrobial effects at low/ non-toxic concentrations to human keratinocyte cells, blast and melanoma rat cell lines. Moreover, we show that silver/(Cu, Ni, and Zn) increase prokaryotic cell permeability at sub-inhibitory concentrations, demonstrating this to be a possible mechanism of the synergistic behavior. Together, these results suggest that these combinatorial treatments will play an important role in the future development of antimicrobial agents and treatments against infections. In specific, the cytotoxicity experiments show that the combinations have great potential in the treatment of topical infections

In vivo antimicrobial activity of silver nanoparticles produced via a green chemistry synthesis using Acacia rigidula as a reducing and capping agent

Introduction: One of the main issues in the medical field and clinical practice is the development of novel and effective treatments against infections caused by antibiotic-resistant bacteria. One avenue that has been approached to develop effective antimicrobials is the use of silver nanoparticles (Ag-NPs), since they have been found to exhibit an efficient and wide spectrum of antimicrobial properties. Among the main drawbacks of using Ag-NPs are their potential cytotoxicity against eukaryotic cells and the latent environmental toxicity of their synthesis methods. Therefore, diverse green synthesis methods, which involve the use of environmentally friendly plant extracts as reductive and capping agents, have become attractive to synthesize Ag-NPs that exhibit antimicrobial effects against resistant bacteria at concentrations below toxicity thresholds for eukaryotic cells. Purpose: In this study, we report a green one-pot synthesis method that uses Acacia rigidula extract as a reducing and capping agent, to produce Ag-NPs with applications as therapeutic agents to treat infections in vivo. Materials and methods: The Ag-NPs were characterized using transmission electron microscopy (TEM), high-resolution TEM, selected area electron diffraction, energy-dispersive spectroscopy, ultraviolet–visible, and Fourier transform infrared. Results: We show that Ag-NPs are spherical with a narrow size distribution. The Ag-NPs show antimicrobial activities in vitro against Gram-negative (Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, and a clinical multidrug-resistant strain of P. aeruginosa) and Gram-positive (Bacillus subtilis) bacteria. Moreover, antimicrobial effects of the Ag-NPs, against a resistant P. aeruginosa clinical strain, were tested in a murine skin infection model. The results demonstrate that the Ag-NPs reported in this work are capable of eradicating pathogenic resistant bacteria in an infection in vivo. In addition, skin, liver, and kidney damage profiles were monitored in the murine infection model, and the results demonstrate that Ag-NPs can be used safely as therapeutic agents in animal models. Conclusion: Together, these results suggest the potential use of Ag-NPs, synthesized by green chemistry methods, as therapeutic agents against infections caused by resistant and nonresistant strains. Keywords: silver nanoparticles, green synthesis, in vitro antibacterial activity, in vivo antibacterial activity, skin infection, toxicological stud

Antimicrobial and antibiofilm activity of biopolymer-Ni, Zn nanoparticle biocomposites synthesized using R. mucilaginosa UANL-001L exopolysaccharide as a capping agent

Introduction: Global increase in the consumption of antibiotics has induced selective stress on wild-type microorganisms, pushing them to adapt to conditions of higher antibiotic concentrations, and thus an increased variety of resistant bacterial strains have emerged. Metal nanoparticles synthesized by green methods have been studied and proposed as potential antimicrobial agents against both wild-type and antibiotic-resistant strains; in addition, exopolysaccharides have been used as capping agent of metal nanoparticles due to their biocompatibility, reducing biological risks in a wide variety of applications.Purpose: In this work, we use an exopolysaccharide, from Rhodotorula mucilaginosa UANL-001L, an autochthonous strain from the Mexican northeast, as a capping agent in the synthesis of Zn, and Ni, nanoparticle biopolymer biocomposites.Materials and methods: To physically and chemically characterize the synthesized biocomposites, FT-IR, UV-Vs, TEM, SAED and EDS analysis were carried out. Antimicrobial and antibiofilm biological activity were tested for the biocomposites against two resistant clinical strains, a Gram-positive Staphylococcus aureus, and a Gram-negative Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial activity was determined using a microdilution assay whereas antibiofilm activity was analyzed through crystal violet staining.Results: Biocomposites composed of exopolysaccharide capped Zn and Ni metal nanoparticles were synthesized through a green synthesis methodology. The average size of the Zn and Ni nanoparticles ranged between 8 and 26 nm, respectively. The Ni-EPS biocomposites showed antimicrobial and antibiofilm activity against resistant strains of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa at 3 and 2 mg/mL, respectively. Moreover, Zn-EPS biocomposites showed antimicrobial activity against resistant Staphylococcus aureus at 1 mg/mL. Both biocomposites showed no toxicity, as renal function showed no differences between treatments and control in the in vivo assays with male rats tests in this study at a concentration of 24 mg/kg of body weight. Conclusion: The exopolysaccharide produced by Rhodotorula mucilaginosa UANL-001L is an excellent candidate as a capping agent in the synthesis of biopolymer-metal nanoparticle biocomposites. Both Ni and Zn-EPS biocomposites demonstrate to be potential contenders as novel antimicrobial agents against both Gram-negative and Gram-positive clinically relevant resistant bacterial strains. Moreover, Ni-EPS biocomposites also showed antibiofilm activity, which makes them an interesting material to be used in different applications to counterattack global health problems due to the emergence of resistant microorganisms

Re-sensitizing Ampicillin and Kanamycin-Resistant E. coli and S. aureus Using Synergistic Metal Micronutrients-Antibiotic Combinations

Due to the recent emergence of multi-drug resistant strains, the development of novel antimicrobial agents has become a critical issue. The use of micronutrient transition metals is a promising approach to overcome this problem since these compounds exhibit significant toxicity at low concentrations in prokaryotic cells. In this work, we demonstrate that at concentrations lower than their minimal inhibitory concentrations and in combination with different antibiotics, it is possible to mitigate the barriers to employ metallic micronutrients as therapeutic agents. Here, we show that when administered as a combinatorial treatment, Cu2+, Zn2+, Co2+, Cd2+, and Ni2+ increase susceptibility of Escherichia coli and Staphylococcus aureus to ampicillin and kanamycin. Furthermore, ampicillin-resistant E. coli is re-sensitized to ampicillin when the ampicillin is administered in combination with Cu2+, Cd2+, or Ni2. Similarly, Cu2+, Zn2+, or Cd2+ re-sensitize kanamycin-resistant E. coli and S. aureus to kanamycin when administered in a combinatorial treatment with those transition metals. Here, we demonstrate that for both susceptible and resistant bacteria, transition-metal micronutrients, and antibiotics interact synergistically in combinatorial treatments and exhibit increased effects when compared to the treatment with the antibiotic alone. Moreover, in vitro and in vivo assays, using a murine topical infection model, showed no toxicological effects of either treatment at the administered concentrations. Lastly, we show that combinatorial treatments can clear a murine topical infection caused by an antibiotic-resistant strain. Altogether, these results suggest that antibiotic-metallic micronutrient combinatorial treatments will play an important role in future developments of antimicrobial agents and treatments against infections caused by both susceptible and resistant strains