El sistema de fosforilación oxidativa en el Síndrome de Down

El Síndrome de Down, una enfermedad causada por la trisomía del cromosoma 21, es el trastorno genómico más común de la discapacidad intelectual. En este trabajo fin de máster nos vamos a centrar en el estudio de varios genes localizados en el cromosoma 21 que están sobreexpresados en el Síndrome de Down. Su sobreexpresión reduce la biogénesis mitocondrial y la fosforilación oxidativa, lo que conlleva efectos negativos en la neurogénesis. Los genes objeto de estudio son BACH1, DYRK1A, NRIP1, PFKL, PKNOX1 y RCAN1. Mediante técnicas para medir la expresión génica, Real Time PCR y Western Blot, se ha comprobado la sobreexpresión de dichos genes en células SH-SY5Y, una línea celular de neuroblastoma humano que puede diferenciarse a neurona. Posteriormente, se ha estudiado el efecto de dicha sobreexpresión sobre la biogénesis y funcionalidad mitocondrial, la viabilidad celular y la diferenciación a neurona de estas células SH-SY5Y. Finalmente, en la búsqueda de fármacos que, mejorando la biogénesis mitocondrial, puedan ser utilizados en el tratamiento prenatal de fetos con Síndrome de Down se ha comprobado como la hemina, a una concentración 10 µM, reduce los niveles de BACH1 en células SH-SY5Y que sobreexpresan este gen sin afectar a la viabilidad celular. <br /

Estudio de factores genéticos que afectan a casos esporádicos de la Enfermedad de Parkinson

El Parkinson es un desorden neurodegenerativo que se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Los síntomas característicos de la enfermedad son: temblor, bradiquinesia (lentitud de movimientos), rigidez articular e inestabilidad postural. En algunos casos, la enfermedad se hereda de forma autosómica dominante por mutaciones en genes puntuales como SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 y HTRA2. Pero en la mayoría de los casos se trata de una enfermedad en la que intervienen distintos factores, tanto genéticos como ambientales, y cuyo factor de riesgo más importante es la edad. Tras el descubrimiento, en numerosos estudios, de deficiencias en la biogénesis y la morfología mitocondriales en pacientes que cursaban la enfermedad, en los últimos años se ha planteado que las mitocondrias pueden ser uno de los factores implicados en el desarrollo de la misma. En base a esto, nuestro grupo busca establecer correlación entre diferentes haplotipos de DNA mitocondrial (mtDNA) y la posibilidad de desarrollar la enfermedad. Para ello, no sirven modelos animales, sino que es necesario realizar los estudios en líneas celulares de origen humano en las que no se habían caracterizado previamente los genes y proteínas involucrados en la Enfermedad de Parkinson. Esta caracterización se muestra en el presente trabajo fin de máster, además de un estudio de la sobreexpresión de uno de los genes más importantes para el mantenimiento del mtDNA, el gen Parkina

Modelos celulares de enfermedad mitocondrial causada por mutaciones en POLG

Las enfermedades mitocondriales constituyen un grupo de trastornos originados por una deficiente síntesis de ATP por el sistema OXPHOS. Mutaciones en la DNA polimerasa mitocondrial gamma (POLG), única DNA polimerasa mitocondrial humana conocida y esencial para la replicación y reparación del DNA mitocondrial, producen diversas enfermedades mitocondriales con manifestaciones clínicas muy heterogéneas. Sin embargo, estas mutaciones tienen en común la presencia de diversos grados de afectación neuronal, que lleva a neurodegeneración. A pesar de que el cerebro representa solo el 2 % del peso corporal, consume el 20 % de la energía corporal. La mayor parte de esta energía es consumida por las neuronas y es el sistema OXPHOS el que la produce. Con el objetivo final de caracterizar el efecto de mutaciones patológicas de la DNA polimerasa mitocondrial gamma en la diferenciación neuronal y en el sistema OXPHOS de neuronas maduras, en este trabajo, se han caracterizado a nivel genético, molecular y funcional líneas celulares derivadas de neuroblastoma (que pueden diferenciarse a neurona) sobreexpresando POLG silvestre, POLG con una variante portadora de una mutación autosómica dominante o POLG con una variante previamente asociada a Parkinson. Con estos estudios, hemos comprobado que la sobreexpresión de la mutación patológica afecta a la replicación del DNA mitocondrial en la línea SH-SY5Y en cultivo, quedando disponible para comenzar los estudios de diferenciación neuronal. Por otro lado, se han caracterizado a nivel genético y molecular 3 líneas cíbridas para los haplogrupos mitocondriales: H, UK y J, derivadas de neuroblastoma sobreexpresando POLG silvestre, o la variante de POLG previamente asociada a Parkinson. Una vez caracterizadas se estudiará el efecto combinado que pueden tener variaciones genéticas mitocondriales y nucleares en la diferenciación a neurona dopaminérgica

Modelos celulares para el estudio de factores genéticos asociados a casos esporádicos de enfermedad de Parkinson.

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más extendida, con síntomas principalmente motores y caracterizada por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Su etiología combina factores genéticos, nucleares y mitocondriales, con factores ambientales. Este proyecto se centra en el estudio del papel del sistema OXPHOS y la mitocondria en la enfermedad. Para ello, se han caracterizado líneas celulares derivadas de neuroblastoma y células madre neurales por su potencial para diferenciarse a neuronas dopaminérgicas, las principales células afectadas en la enfermedad. Se ha descartado la presencia de mutaciones patológicas en los genes POLG y LRRK2 en dichas líneas celulares y se han generado líneas derivadas que sobreexpresan variantes de las proteínas Parkina y POLG relacionadas con la enfermedad. En ellas se ha comprobado la incorporación de la mutación, se ha cuantificado la expresión de mRNA mediante q-PCR, con sonda o tinción con Sybr Green respectivamente y se ha analizado la expresión proteica mediante inmunodetección indirecta. También se ha estudiado en una línea derivada de neuroblastoma el efecto de la diferenciación dopaminérgica sobre las proteínas PINK1 y HtrA2. Para finalizar, se discute la relación de la EP con otras patologías y se proponen nuevas estrategias para abordar el estudio de la enfermedad, como la generación de cíbridos transmitocondriales

Oxidative phosphorylation dysfunction modifies the cell secretome

Mitochondrial oxidative phosphorylation disorders are extremely heterogeneous conditions. Their clinical and genetic variability makes the identification of reliable and specific biomarkers very challenging. Until now, only a few studies have focused on the effect of a defective oxidative phosphorylation functioning on the cell’s secretome, although it could be a promising approach for the identification and pre-selection of potential circulating biomarkers for mitochondrial diseases. Here, we review the insights obtained from secretome studies with regard to oxidative phosphorylation dysfunction, and the biomarkers that appear, so far, to be promising to identify mitochondrial diseases. We propose two new biomarkers to be taken into account in future diagnostic trials

Brain pyrimidine nucleotide synthesis and Alzheimer disease

Many patients suffering late-onset Alzheimer disease show a deficit in respiratory complex IV activity. The de novo pyrimidine biosynthesis pathway connects with the mitochondrial respiratory chain upstream from respiratory complex IV. We hypothesized that these patients would have decreased pyrimidine nucleotide levels. Then, different cell processes for which these compounds are essential, such as neuronal membrane generation and maintenance and synapses production, would be compromised. Using a cell model, we show that inhibiting oxidative phosphorylation function reduces neuronal differentiation. Linking these processes to pyrimidine nucleotides, uridine treatment recovers neuronal differentiation. To unmask the importance of these pathways in Alzheimer disease, we firstly confirm the existence of the de novo pyrimidine biosynthesis pathway in adult human brain. Then, we report altered mRNA levels for genes from both de novo pyrimidine biosynthesis and pyrimidine salvage pathways in brain from patients with Alzheimer disease. Thus, uridine supplementation might be used as a therapy for those Alzheimer disease patients with low respiratory complex IV activity