Clonación y sobreexpresión de genes localizados en el cromosoma 21 humano relacionados con la función OXPHOS.

El síndrome de Down es el trastorno genómico más común responsable de discapacidad intelectual y está causado por la trisomía del cromosoma 21. Este síndrome se asocia a dificultades intelectuales y cognitivas, pero hay múltiples sistemas involucrados. En el Síndrome de Down la sobreexpresión de los genes del cromosoma 21 es la responsable de la patogénesis de esta enfermedad. Hay 222 genes que codifican para proteínas localizados en el cromosoma 21 pero en este trabajo fin de grado nos vamos a centrar en aquellos que afectan al sistema de fosforilación oxidativa (OXPHOS) pudiendo producir un efecto negativo sobre la biogénesis mitocondrial y, por tanto, producen una disminución de la síntesis de ATP necesaria para la neurogénesis. Los genes en los que se centra este trabajo son: BACH1, DYRK1A, RCAN1, NRIP1, PKNOX1 y PFKL. El objetivo de este trabajo es conseguir clonar estos 6 genes localizados en el cromosoma 21 y relacionados con la patogénesis de la enfermedad de Síndrome de Down en vectores lentivirales de transferencia. Posteriormente, estos vectores lentivirales se usarán para la producción de partículas lentivirales y transducir con ellas células SH-SY5Y, una línea celular de neuroblastoma humano que puede diferenciarse a neurona. Finalmente, una vez clonados los genes se busca la sobreexpresión de los mismos en células SH-SY5Y, para estudiar el efecto de dicha sobreexpresión en la función OXPHOS y en la diferenciación de la línea celular SH-SY5Y a neurona.<br /

Biomarcadores para el diagnóstico de Enfermedades Mitocondriales

Las enfermedades mitocondriales son un grupo heterogéneo de enfermedades genéticas causadas por mutaciones en el ADN mitocondrial o el nuclear que se caracterizan por afectar al funcionamiento de la cadena respiratoria mitocondrial, el sistema de fosforilación oxidativa. Se pueden presentar tanto en la infancia como en la edad adulta. Debido a la gran variedad de presentación clínica, su diagnóstico requiere un equipo multidisciplinar de especialistas. Sin embargo, a veces no es posible llegar a un diagnóstico o éste se retrasa. Dada la complejidad de su diagnóstico, la identificación de un biomarcador es altamente necesaria. Un biomarcador es un indicador de la presencia de un proceso biológico o patológico usado para el diagnóstico de la enfermedad, para monitorizar su progreso o la respuesta del paciente a un tratamiento.En este Trabajo de Fin de Grado se ha recopilado información de las investigaciones y trabajos de revisión sobre los biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades mitocondriales. Son biomarcadores que se suelen utilizar en la primera fase del diagnóstico, de dichas enfermedades. Biomarcadores en suero como piruvato, lactato, índice lactato/piruvato, o carnitinas, entre otras moléculas, son utilizados en el algoritmo diagnóstico, pero no son específicos de este grupo de enfermedades. Esta es una conclusión repetida en varias investigaciones.En otros estudios, el factor de diferenciación de crecimiento 15 (GFD15) y el factor de crecimiento fibroblástico 21 (FGF21) se han propuesto como moléculas prometedoras para identificar enfermedades mitocondriales. Además, parecen más fiables para identificar enfermedades mitocondriales cuando se analizan juntos. Esto ha llevado a buscar una huella biológica formada por varias moléculas para el diagnóstico de las enfermedades mitocondriales en lugar de una única molécula. Hasta ahora, no se han podido incluir nuevos biomarcadores para el diagnóstico de enfermedades mitocondriales en clínica. Se necesitan de cohortes más grandes para probar su utilidad. <br /

El sistema de fosforilación oxidativa en el Síndrome de Down

El Síndrome de Down, una enfermedad causada por la trisomía del cromosoma 21, es el trastorno genómico más común de la discapacidad intelectual. En este trabajo fin de máster nos vamos a centrar en el estudio de varios genes localizados en el cromosoma 21 que están sobreexpresados en el Síndrome de Down. Su sobreexpresión reduce la biogénesis mitocondrial y la fosforilación oxidativa, lo que conlleva efectos negativos en la neurogénesis. Los genes objeto de estudio son BACH1, DYRK1A, NRIP1, PFKL, PKNOX1 y RCAN1. Mediante técnicas para medir la expresión génica, Real Time PCR y Western Blot, se ha comprobado la sobreexpresión de dichos genes en células SH-SY5Y, una línea celular de neuroblastoma humano que puede diferenciarse a neurona. Posteriormente, se ha estudiado el efecto de dicha sobreexpresión sobre la biogénesis y funcionalidad mitocondrial, la viabilidad celular y la diferenciación a neurona de estas células SH-SY5Y. Finalmente, en la búsqueda de fármacos que, mejorando la biogénesis mitocondrial, puedan ser utilizados en el tratamiento prenatal de fetos con Síndrome de Down se ha comprobado como la hemina, a una concentración 10 µM, reduce los niveles de BACH1 en células SH-SY5Y que sobreexpresan este gen sin afectar a la viabilidad celular. <br /

Estudio de factores genéticos que afectan a casos esporádicos de la Enfermedad de Parkinson

El Parkinson es un desorden neurodegenerativo que se caracteriza por la presencia de cuerpos de Lewy y la degeneración de las neuronas dopaminérgicas de la sustancia negra. Los síntomas característicos de la enfermedad son: temblor, bradiquinesia (lentitud de movimientos), rigidez articular e inestabilidad postural. En algunos casos, la enfermedad se hereda de forma autosómica dominante por mutaciones en genes puntuales como SNCA, PARK2, PINK1, DJ-1, LRRK2 y HTRA2. Pero en la mayoría de los casos se trata de una enfermedad en la que intervienen distintos factores, tanto genéticos como ambientales, y cuyo factor de riesgo más importante es la edad. Tras el descubrimiento, en numerosos estudios, de deficiencias en la biogénesis y la morfología mitocondriales en pacientes que cursaban la enfermedad, en los últimos años se ha planteado que las mitocondrias pueden ser uno de los factores implicados en el desarrollo de la misma. En base a esto, nuestro grupo busca establecer correlación entre diferentes haplotipos de DNA mitocondrial (mtDNA) y la posibilidad de desarrollar la enfermedad. Para ello, no sirven modelos animales, sino que es necesario realizar los estudios en líneas celulares de origen humano en las que no se habían caracterizado previamente los genes y proteínas involucrados en la Enfermedad de Parkinson. Esta caracterización se muestra en el presente trabajo fin de máster, además de un estudio de la sobreexpresión de uno de los genes más importantes para el mantenimiento del mtDNA, el gen Parkina

Caracterización del gen MAPT en modelos celulares para el estudio de la enfermedad de Alzheimer

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo caracterizado por la presencia de placas seniles y ovillos neurofibrilares en el cerebro, formados por depósitos del péptido β-amiloide y la proteína tau hiperfosforilada, respectivamente. El origen de la enfermedad y las bases moleculares de la misma siguen en estudio, ámbito en el que desde nuestro grupo se ha establecido una hipótesis que relaciona al sistema OXPHOS, la síntesis de novo de pirimidinas y la EA. Para comprobar esta hipótesis es necesario investigar las bases moleculares de la enfermedad y para ello deben validarse modelos de estudio de forma previa. En el presente trabajo se ha llevado a cabo la validación de las líneas celulares hNSC, SH-SY5Y y SK-N-BE(2)-C como modelos adecuados a fin de diferenciarlas a neuronas colinérgicas y estudiar la proteína tau en ensayos posteriores. En concreto, se ha realizado la caracterización del gen MAPT (Microtubule-associated protein tau), codificante para la proteína tau, mediante el análisis de la expresión del gen y del ratio del grupo de isoformas 3R y 4R (establecidas por splicing alternativo del exón 10), así como la búsqueda de las 6 isoformas mayoritarias presentes en cerebro adulto humano y el estudio de las variaciones genéticas de MAPT. En las líneas SK-N-BE(2)-C y SH-SY5Y no se han encontrado variaciones en los transcritos secuenciados de MAPT y se ha observado un claro predominio de la isoforma fetal con respecto a las demás. Sin embargo, más ensayos son necesarios para validar la línea hNSC antes de su utilización, ya que sólo ha podido determinarse la mayor expresión de las isoformas 3R en esta línea celular

Modelos celulares de enfermedad mitocondrial causada por mutaciones en POLG

Las enfermedades mitocondriales constituyen un grupo de trastornos originados por una deficiente síntesis de ATP por el sistema OXPHOS. Mutaciones en la DNA polimerasa mitocondrial gamma (POLG), única DNA polimerasa mitocondrial humana conocida y esencial para la replicación y reparación del DNA mitocondrial, producen diversas enfermedades mitocondriales con manifestaciones clínicas muy heterogéneas. Sin embargo, estas mutaciones tienen en común la presencia de diversos grados de afectación neuronal, que lleva a neurodegeneración. A pesar de que el cerebro representa solo el 2 % del peso corporal, consume el 20 % de la energía corporal. La mayor parte de esta energía es consumida por las neuronas y es el sistema OXPHOS el que la produce. Con el objetivo final de caracterizar el efecto de mutaciones patológicas de la DNA polimerasa mitocondrial gamma en la diferenciación neuronal y en el sistema OXPHOS de neuronas maduras, en este trabajo, se han caracterizado a nivel genético, molecular y funcional líneas celulares derivadas de neuroblastoma (que pueden diferenciarse a neurona) sobreexpresando POLG silvestre, POLG con una variante portadora de una mutación autosómica dominante o POLG con una variante previamente asociada a Parkinson. Con estos estudios, hemos comprobado que la sobreexpresión de la mutación patológica afecta a la replicación del DNA mitocondrial en la línea SH-SY5Y en cultivo, quedando disponible para comenzar los estudios de diferenciación neuronal. Por otro lado, se han caracterizado a nivel genético y molecular 3 líneas cíbridas para los haplogrupos mitocondriales: H, UK y J, derivadas de neuroblastoma sobreexpresando POLG silvestre, o la variante de POLG previamente asociada a Parkinson. Una vez caracterizadas se estudiará el efecto combinado que pueden tener variaciones genéticas mitocondriales y nucleares en la diferenciación a neurona dopaminérgica

Estudio de patogenicidad de la mutación c.1036C>T en el gen TEFM

La transcripción del mtDNA es uno de los procesos más importantes en la regulación de la biosíntesis del sistema OXPHOS y en el mantenimiento del mtDNA por estar conectada con la replicación del mismo. La RNA polimerasa mitocondrial humana (POLRMT) actúa como molécula central de la transcripción, que se divide en tres etapas: iniciación, elongación y terminación. Para que se produzca la elongación es necesario el factor de elongación de la transcripción (TEFM), que aumenta la procesividad de POLRMT y se encuentra codificado por el gen nuclear TEFM. En el presente trabajo se ha llevado a cabo un estudio de la mutación c.1036C>T en TEFM presente en el paciente 3304, que cursa con déficit serotoninérgico y disfunción hipotalámica, con el objetivo de determinar si es la responsable de la etiología de su enfermedad. Para ello, se ha analizado bioinformáticamente el carácter patológico de la mutación, se ha caracterizado el mtDNA del paciente y se ha valorado la existencia o ausencia de disfunción mitocondrial a nivel de producción de ATP, transcripción mitocondrial, cuantificación de subunidades del sistema OXPHOS y formación de complejos y supercomplejos respiratorios. Además, se ha aplicado un ensayo de complementación genética para analizar la recuperación de la función mitocondrial. La mutación c.1036C>T se predice como patológica, el paciente carece de mutaciones en su mtDNA y presenta una disfunción mitocondrial que podría estar relacionada con los síntomas de su enfermedad. Finalmente, la sobreexpresión de TEFM wt perjudica la funcionalidad mitocondrial de las células del paciente, imposibilitando la terapia génica como tratamiento

Modelos celulares para el estudio de factores genéticos asociados a casos esporádicos de enfermedad de Parkinson.

La enfermedad de Parkinson (EP) es la segunda enfermedad neurodegenerativa más extendida, con síntomas principalmente motores y caracterizada por la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la sustancia negra. Su etiología combina factores genéticos, nucleares y mitocondriales, con factores ambientales. Este proyecto se centra en el estudio del papel del sistema OXPHOS y la mitocondria en la enfermedad. Para ello, se han caracterizado líneas celulares derivadas de neuroblastoma y células madre neurales por su potencial para diferenciarse a neuronas dopaminérgicas, las principales células afectadas en la enfermedad. Se ha descartado la presencia de mutaciones patológicas en los genes POLG y LRRK2 en dichas líneas celulares y se han generado líneas derivadas que sobreexpresan variantes de las proteínas Parkina y POLG relacionadas con la enfermedad. En ellas se ha comprobado la incorporación de la mutación, se ha cuantificado la expresión de mRNA mediante q-PCR, con sonda o tinción con Sybr Green respectivamente y se ha analizado la expresión proteica mediante inmunodetección indirecta. También se ha estudiado en una línea derivada de neuroblastoma el efecto de la diferenciación dopaminérgica sobre las proteínas PINK1 y HtrA2. Para finalizar, se discute la relación de la EP con otras patologías y se proponen nuevas estrategias para abordar el estudio de la enfermedad, como la generación de cíbridos transmitocondriales

Uridine Prevents Negative Effects of OXPHOS Xenobiotics on Dopaminergic Neuronal Differentiation

Neuronal differentiation appears to be dependent on oxidative phosphorylation capacity. Several drugs inhibit oxidative phosphorylation and might be detrimental for neuronal differentiation. Some pregnant women take these medications during their first weeks of gestation when fetal nervous system is being developed. These treatments might have later negative consequences on the offspring’s health. To analyze a potential negative effect of three widely used medications, we studied in vitro dopaminergic neuronal differentiation of cells exposed to pharmacologic concentrations of azidothymidine for acquired immune deficiency syndrome; linezolid for multidrug-resistant tuberculosis; and atovaquone for malaria. We also analyzed the dopaminergic neuronal differentiation in brains of fetuses from pregnant mice exposed to linezolid. The drugs reduced the in vitro oxidative phosphorylation capacity and dopaminergic neuronal differentiation. This differentiation process does not appear to be affected in the prenatally exposed fetus brain. Nevertheless, the global DNA methylation in fetal brain was significantly altered, perhaps linking an early exposure to a negative effect in older life. Uridine was able to prevent the negative effects on in vitro dopaminergic neuronal differentiation and on in vivo global DNA methylation. Uridine could be used as a protective agent against oxidative phosphorylation-inhibiting pharmaceuticals provided during pregnancy when dopaminergic neuronal differentiation is taking place

In situ AFM observations of mineral replacement reactions on sulphate and carbonate surfaces

Depto. de Mineralogía y PetrologíaFac. de Ciencias GeológicasTRUEpu