Efecto de la microcina J25 en la cadena respiratoria de Escherichia coli

En la actualidad existe una marcada tendencia a la demanda de alimentos naturales con pocos procesamientos. Además, el uso indiscriminado de antibióticos de amplio espectro ha provocado el aumento de bacterias patógenas multiresistentes a los antibióticos existentes. Las bacteriocinas son consideradas como una posible solución ante esta problemática. En particular, la microcina J25 (MccJ25) es una bacteriocina muy estable activa frente a patógenos transmitidos por alimentos, entre ellos Escherichia coli, Salmonella y Shigella. Posee dos mecanismos de acción, inhibe la transcripción mediante la unión a la ARN polimerasa e inhibe la cadena respiratoria residente en la membrana plasmática.El objetivo de esta tesis fue profundizar el conocimiento del efecto de la MccJ25 sobre la cadena respiratoria de E. coli. A partir de resultados previos, se planteó la hipótesis de que el péptido actúa sobre los citocromos. En la cadena respiratoria de E. coli existen dos tipos de ubiquinol oxidasas, el citocromo bo3 y los citocromos bd (bdI y bdII). Se demostró, in vivo, que estos son fundamentales para la acción inhibitoria de la microcina, siendo las oxidasas más importante los citocromos bo3 y bdI. Empleando cepas de E. coli que tienen aumentada la entrada de la MccJ25 mediante el aumento de expresión de la proteína transportadora FhuA, se observó que las mutantes en los citocromos bo3 y bdI mostraron una marcada disminución de la sensibilidad frente al péptido con respecto a la cepa parental. Además, en ensayos llevados a cabo in vitro el péptido fue capaz de inhibir la actividad ubiquinol oxidasa y de inducir un aumento en la producción de especies reactivas del oxígeno cuando se utilizó el citocromo bdI purificado a partir de la membrana de E. coli. Esta inhibición es dosis dependiente y según las constantes cinéticas (Km y Vmax) sería de tipo no competitiva. Sin embargo, no se observó este mismo efecto cuando el ensayo fue realizado en presencia del citocromo bo3. Por otro lado, el análisis de la diferencia entre los espectros de la forma reducida y oxidada de los citocromos manifestó una reducción directa del citocromo bdI por parte de la MccJ25. Estos resultados indicarían que la MccJ25 podría inhibir de manera directa solo al citocromo bdI. Actualmente, el citocromo bdI es un potencial blanco de acción para antibióticos alternativos ya que solo se encuentra en células procariotas, entre ellas patógenos tales como E. coli, Mycobacterium tuberculosis y Klebsiella pneumonia. Dada la existencia de una relación estructural entre el citocromo bo3 y el complejo IV de la mitocondria se proyectan estudios más profundos para dilucidar el mecanismo de inhibición de la MccJ25 sobre los citocromos. Esto permitiría el desarrollo de estrategias para dirigir específicamente la actividad del péptido al citocromo bdI. De esta manera sería posible diseñar péptidos modificados más eficaces sobre este blanco de acción. La MccJ25 por su naturaleza y porsu capacidad de actuar sobre dos dianas diferentes, una a nivel intracelular y otra a nivel de la cadena respiratoria, es una alternativa prometedora para ser considerada como un nuevo antimicrobiano.At present there is a pronounced tendency to demand for minimally processed natural foods. Furthermore, misuse of broad-spectrum antibiotics has led to an increase in resistant pathogenic bacteria. Bacteriocins could be considered as a possible solution to this issue. Microcin J25 (MccJ25) is a very stable bacteriocin active against foodborne pathogens, including Escherichia coli, Salmonella and Shigella. This peptide has two targets, one of them is the RNA polymerase through the binding to its secondary channel and the other is the respiration that involves the inhibition of enzymes of respiratory chain. The aim of this thesis was to deepen the knowledge of the effect of MccJ25 on E. coli respiratory chain. From previous results, we hypothesized that the peptide acts on cytochromes. E. coli respiratory chain has two types of ubiquinol terminal oxidases, cytochrome bo3 and cytochromes bd (bdI and bdII). In this work, we demonstrated that these are essential for the peptide inhibitory effect, where cytochromes bo3 and bdI play a fundamental role. The entry of MccJ25 to the target cell was increased by over-expressing the transporter protein FhuA. The cytochromes bo3 and bdI mutants showed a marked decrease sensitivity to the peptide regarding the parental. Additionally, in vitro assays performed using purified cytochrome bdI from E. coli membrane, revealed that the peptide was able to inhibit its ubiquinol oxidase activity and induced an increase in the reactive oxygen species production. This inhibition is dose dependent and it would be a noncompetitive type inhibition according to its kinetic constants (Km and Vmax). However, this effect was not observed when assay was performed with cytochrome bo3. Furthermore, the analyses of reduced minus air-oxidized difference spectra of the purified cytochromes manifested a direct reduction of cytochrome bdI by MccJ25. These findings indicate that MccJ25 could just inhibit cytochrome bdI in a direct way. Cytochrome bdI is found only in prokaryotes, including pathogens such as E. coli, Mycobacterium tuberculosis and Klebsiella pneumonia. Currently, this cytochrome is a potential target for alternative antibiotic. There is a structural relationship between cytochrome bo3 and mitochondrial complex IV. It exist a growing need for deeper studies to elucidate MccJ25 mechanism of cytochromes inhibition. These would allow a development of strategies to specifically lead the peptide activity to the cytochrome bdI. Thereby it would be possible to design modified peptides that are more effective on this target. By its nature and its ability to act on two different cellular targets, one inside the cell and the other at the respiratory chain, MccJ25 is a promising alternative to be considered as a new potential antimicrobialsFil: Galván, Adriana Emilce. Universidad Nacional de Tucumán. Facultad de Bioquímica, Química y Farmacia; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentin

New insights into enterocin CRL35: mechanism of action and immunity revealed by heterologous expression in Escherichia coli

The role of the class IIa bacteriocin membrane receptor protein remains unclear, and the following two different mechanisms have been proposed: the bacteriocin could interact with the receptor changing it to an open conformation or the receptor might act as an anchor allowing subsequent bacteriocin insertion and membrane disruption. Bacteriocin-producing cells synthesize an immunity protein that forms an inactive bacteriocin–receptor–immunity complex. To better understand the molecular mechanism of enterocin CRL35, the peptide was expressed as the suicidal probe EtpM-enterocin CRL35 in Escherichia coli, a naturally insensitive microorganism since it does not express the receptor. When the bacteriocin is anchored to the periplasmic face of the plasma membrane through the bitopic membrane protein, EtpM, E. coli cells depolarize and die. Moreover, co-expression of the immunity protein prevents the deleterious effect of EtpM-enterocin CRL35. The binding and anchoring of the bacteriocin to the membrane has demonstrated to be a sufficient condition for its membrane insertion. The final step of membrane disruption by EtpM-enterocin CRL35 is independent from the receptor, which means that the mannose PTS might not be involved in the pore structure. In addition, the immunity protein can protect even in the absence of the receptor.Fil: Barraza, Daniela Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Ríos Colombo, Natalia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Galván, Adriana Emilce. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Acuña, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Minahk, Carlos Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Bellomio, Augusto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Chalon, Miriam Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentin

In vivo systems to study class II bacteriocins toxicity and immunity

Class II bacteriocins are membrane-active peptides that act over a narrowspectrum of bacterial targets and have a great potential application as antibioticsin medical sciences. They act on the cytoplasmic membrane dissipating thetransmembrane potential by forming pores. There is solid evidence thatmembrane receptor proteins are necessary for their function, however the preciserole of this receptor and the nature of the pore remain elusive. The most acceptedmodel suggest that bacteriocins bind the receptor to change its conformation,creating a channel that remains open. Nonetheless, several studies support asecond model in which the bacteriocin is able to disrupt the membrane itself andthe receptor might act just as an anchor allowing the subsequent bacteriocininsertion to form the pore. In order to reveal whether or not the pore structureinvolves the specific receptor, we designed chimeric peptides fusing themembrane protein EtpM with different class II bacteriocins. We chose E. coli as areceptor-free expression host. The fusion EtpM-bacteriocin anchors eachbacteriocin to the membrane and kills the expressing host cell, even in theabsence of the specific receptor. These results are in line with the second model inwhich the pore is formed through a receptor-independent interaction with the lipidbilayer. The effect of these interactions was also analyzed, through a fluorophorethat changes its fluorescence intensity according to transmembrane potential.On the other hand, an immunity protein protects the producer strain against itsown bacteriocin. For antimicrobials under investigation for clinical applications, thepotential emergence of resistant pathogens and the study of immune mechanismsare a primary concern. Though no direct in vitro interaction bacteriocin-immunityhas been reported before, by using an in vivo system, we present evidence thatthis binding might occur, not in aqueous solution but in a membrane inserted .Fil: Ríos Colombo, Natalia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Chalon, Miriam Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Galván, Adriana Emilce. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Navarro, Silvia Adriana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Lanza, Lucía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Barraza, Daniela Estefanía. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Acuña, Leonardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Fernandez de Ullivarri, Miguel. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Minahk, Carlos Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Bellomio, Augusto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaXLVII Reunión Anual de la Sociedad Argentina de BiofísicaLa PlataArgentinaSociedad Argentina de Biofísic

Chemical synthesis of the organoarsenical antibiotic arsinothricin

We report two routes of chemical synthesis of arsinothricin (AST), the novel organoarsenical antibiotic. One is by condensation of the 2-chloroethyl(methyl)arsinic acid with acetamidomalonate, and the second involves reduction of the N-acetyl protected derivative of hydroxyarsinothricin (AST-OH) and subsequent methylation of a trivalent arsenic intermediate with methyl iodide. The enzyme AST N-acetyltransferase (ArsN1) was utilized to purify l-AST from racemic AST. This chemical synthesis provides a source of this novel antibiotic for future drug development

Cytochromes bd-I and bo3 are essential for the bactericidal effect of microcin J25 on Escherichia coli cells

Microcin J25 has two targets in sensitive bacteria, the RNA polymerase, and the respiratory chain through inhibition of cellular respiration. In this work, the effect of microcin J25 in E. coli mutants that lack the terminal oxidases cytochrome bd-I and cytochrome bo3 was analyzed. The mutant strains lacking cytochrome bo3 or cytochrome bd-I were less sensitive to the peptide. In membranes obtained from the strain that only expresses cytochrome bd-I a great ROS overproduction was observed in the presence of microcin J25. Nevertheless, the oxygen consumption was less inhibited in this strain, probably because the oxygen is partially reduced to superoxide. There was no overproduction of ROS in membranes isolated from the mutant strain that only express cytochrome bo3 and the inhibition of the cellular respiration was similar to the wild type. It is concluded that both cytochromes bd-I and bo3 are affected by the peptide. The results establish for the first time a relationship between the terminal oxygen reductases and the mechanism of action of microcin J25.Fil: Galván, Adriana Emilce. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Chalon, Miriam Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Schurig Briccio, Lici Ariane. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentina. University of Illinois at Urbana; Estados UnidosFil: Salomon, Raul Armando. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Minahk, Carlos Javier. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Gennis, R. B.. University of Illinois; Estados UnidosFil: Bellomio, Augusto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentin

Microcin J25 inhibits ubiquinol oxidase activity of purified cytochrome bd-I from Escherichia coli

Microcin J25 (MccJ25), an antimicrobial peptide, targets the respiratory chain but the exact mechanism by which it does so remains unclear. Here, we reveal that MccJ25 is able to inhibit the enzymatic activity of the isolated cytochrome bd-I from E. coli and induces at the same time production of reactive oxygen species. MccJ25 behaves as a dose-dependent weak inhibitor. Intriguingly, MccJ25 is capable of producing a change in the oxidation state of cytochrome bd-I causing its partial reduction in the presence of cyanide. These effects are specific for cytochrome bd-I, since the peptide is not able to act on purified cytochrome bo 3 .Fil: Galván, Adriana Emilce. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Chalon, Miriam Carolina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Ríos Colombo, Natalia Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; ArgentinaFil: Schurig Briccio, Lici Ariane. University of Illinois; Estados UnidosFil: Sosa Padilla Araujo, Bernardo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Planta Piloto de Procesos Industriales Microbiológicos; ArgentinaFil: Gennis, Robert B.. University of Illinois; Estados UnidosFil: Bellomio, Augusto. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas. Universidad Nacional de Tucumán. Instituto Superior de Investigaciones Biológicas; Argentin

Arsinothricin, an arsenic-containing non-proteinogenic amino acid analog of glutamate, is a broad-spectrum antibiotic

Nadar, Chen, Dheeman et al. show that arsinothricin, an arsenic-containing non- proteinogenic amino acid analog of glutamate, is an effective broad-spectrum antibiotic through inhibition of glutamine synthetase. This study suggests a possibility of developing a new class of antimicrobials that thwart microbial resistance to arsinothricin