The roles of telR-loops in the stability of telomeres in primary and telomerase-positive cancer cells

Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, 2020, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia.Os telómeros são estruturas nucleoproteicas compostas por heterocromatina que protegem as regiões terminais dos cromossomas lineares eucariotas. Em mamíferos, a estrutura telomérica é essencialmente formada por repetições consecutivas de sequências de DNA em cadeia dupla (5’-TTAGGG-3’), da qual a cadeia rica em guanosina estende-se para além do seu complemento para formar uma protrusão conhecida como G overhang, e por um complexo multiproteico denominado de “shelterin” que assegura a proteção, integridade e regulação dos telómeros. A shelterin humana inclui os seis fatores TRF1, TRF2, TIN2, TPP1, POT1 e Rap1. Em células terminalmente diferenciadas, os telómeros são encurtados a cada ronda de replicação semiconservativa de DNA devido ao seu processamento nucleolítico e à incapacidade da maquinaria convencional de replicação de DNA de processar por completo as regiões 3’ distais de moléculas lineares de DNA durante a síntese da cadeia atrasada. Esta limitação ficou conhecida como end-replication problem. A ausência de um mecanismo de manutenção telomérica resulta na acumulação de telómeros excessivamente curtos e disfuncionais, os quais são reconhecidos como quebras de cadeia dupla (DSBs, do inglês Double-Stranded Breaks). Estes, por sua vez, levam à ativação de uma resposta contra o dano de DNA (DDR, do inglês DNA Damage Response). A estimulação prolongada de DDR induz uma paragem irreversível do ciclo celular conhecida como senescência celular (ou replicativa), podendo progredir para a morte celular. Embora a senescência celular estabeleça um tempo de vida útil a células somáticas incapazes de conservar os seus telómeros, esta é também considerada como um mecanismo decisivo de supressão tumoral. O potencial imortal das células cancerígenas depende da capacidade das mesmas em impedir o desgaste progressivo dos telómeros. Este processo está dependente da ação da enzima telomerase, a transcriptase reversa que permite a adição de novas repetições teloméricas às extremidades dos cromossomas, ou numa menor fração da via alternativa de alongamento de telómeros (ALT, do inglês Alternative Lenghtening of Telomeres), que induz uma reparação dirigida por homologia (HDR, do inglês Homology-Directed Repair). Apesar dos telómeros de mamíferos terem sido considerados transcricionalmente inativos devido à sua constituição heterocromática e à ausência de unidades génicas, estudos realizados pelo nosso grupo revelaram que estes são de facto transcritos em moléculas longas de RNA não-codificante conhecidas como TElomeric Repeat containing RNA (TERRA). Na verdade, não existe ainda uma caracterização completa das funções de TERRA, mas um número crescente de dados sustenta o seu papel na proteção e replicação dos telómeros e na formação de heterocromatina. Adicionalmente, TERRA pode funcionar como um regulador da telomerase, promovendo a elongação telomérica mediada por telomerase in vivo, apesar de inibir a atividade da mesma in vitro. Adicionalmente, TERRA tem a capacidade de emparelhar com a sua cadeia de DNA molde e formar uma estrutura em tripla cadeia constituída por um híbrido de RNA-DNA e uma cadeia codificante deslocada, denominada como R-loop telomérico (telR-loop). Recentemente, o nosso grupo demonstrou que as funcionalidades de TERRA são em parte mediadas pela formação de telR-loops estimulada por TRF2. Observações adicionais em células de levedura telomerase-negativas e pré-senescentes e em células ALT também implicaram os telR-loops na extensão dos telómeros por HDR de modo a compensar parcialmente a erosão das regiões terminais dos cromossomas na ausência de telomerase. Por fim, os telR-loops são regulados pelas enzimas RNase H1 e RNase H2, as quais hidrolisam especificamente a fração de RNA de híbridos de RNA-DNA. Enquanto que a acumulação de telR-loops em células de levedura sem ambas as enzimas retarda a incidência de senescência ao promover HDR telomérico, a remoção de telR-loops através da sobrexpressão de RNase H1 debilita a capacidade de recombinação telomérica e, consequentemente, intensifica o encurtamento dos telómeros e a ocorrência prematura de senescência. Os mecanismos pelos quais a homeostase telomérica é mantida ainda não são inteiramente conhecidos, mas as descobertas recentes acerca da biogénese de TERRA e as novas abordagens direcionadas à sua função trouxeram algum esclarecimento a este tema. Apesar de ainda não ser claro o mecanismo pelo qual TERRA é regulada em concordância com diferentes dinâmicas e estados teloméricos, postula-se que os telR-loops desempenhem um papel central neste processo. Assim, este estudo pretendeu elucidar o papel dos telR-loops na estabilidade dos telómeros em células humanas que expressam, ou não, a telomerase, e caracterizar o mecanismo pelo qual os telR-loops participam na regulação do comprimento dos telómeros mediada por TERRA. Para tal, estabelecemos um sistema celular direcionado aos telómeros e baseado na sobrexpressão de RNase H1 com o intuito de remover especificamente os telR-loops e avaliar a integridade telomérica após a exclusão destas estruturas. Para promover a associação do transgene aos telómeros, o domínio catalítico de RNase H1 humana foi fundido na sua região N-terminal a myc e na região C-terminal a POT1 humana (myc-POT1-RH1 WT). Adicionalmente, três transgenes foram criados, incluindo uma variante de RNase H1 cataliticamente inativa (myc-POT1-RH1 D145G), uma outra constituída ainda pelo seu domínio de ligação a híbridos (HBD, myc-POT1-HBDRH1 WT), e uma versão contendo apenas o domínio POT1, também marcado por myc na região N-terminal (myc-POT1). Os transgenes foram expressos numa linha celular de fibrossarcoma telomerase-positiva (HT1080), em fibroblastos primários de pulmão humano (HLF), e numa linha celular HLF imortalizada através da sobrexpressão da subunidade de transcriptase reversa da telomerase humana (HLF-hTERT). Excecionalmente, myc-POT1-HBDRH1 WT foi incluído apenas em HLF-hTERT. A expressão ectópica controlada por doxiciclina (dox) dos transgenes foi validada por Western Blot e a localização telomérica mediada por POT1 confirmada através de experiências de imunofluorescência com marcação a myc. Os nossos resultados demonstraram que tanto myc-POT1 como myc-POT1-RH1 WT e myc-POT1-RH1 D145G co-localizaram, na sua maioria, com a fração telomérica de HT1080, HLF e HLF-hTERT. Pelo contrário, a deteção de myc-POT1-HBDRH1 WT foi bastante variável e a sua localização também reduzida em telómeros de HLF-hTERT quando comparado com os restantes transgenes. Seguidamente, confirmámos em células HT1080 que a sobrexpressão do domínio catalítico de RNase H1 dirigida aos telómeros induz a degradação de telR-loops no cromossoma 10q. Por outro lado, a variante inativa do transgene promoveu a acumulação dos mesmos. Demonstrámos ainda que a ausência de telR-loops compromete a integridade dos telómeros em todas as linhas celulares testadas devido a um aumento do número de foci induzidos por disfunção telomérica (TIFs, do inglês Telomere Dysfunction-Induced Foci). No entanto, o número de TIFs não continuou a aumentar, o que possivelmente ilustra uma ativação adequada dos mecanismos de reparação de DSBs que bloqueiam a progressão contínua dos danos no DNA telomérico. De notar que a formação de TIFs foi significativamente restringida em células de HT1080 e HLF-hTERT que expressavam myc-POT1-RH1 D145G, sugerindo que, quando desprovido da atividade catalítica, RNase H1 pode fisicamente limitar a dissolução de telR-loops ao protegê-los de possíveis fatores de degradação de R-loops. Finalmente, observámos um aumento da quantidade de cromossomas desprotegidos pela ausência de sinais teloméricos em células HLF que expressavam myc-POT1-RH1 WT, mas não em células HLF-hTERT e HT1080. Por outro lado, a acumulação de telR-loops através da sobrexpressão de myc-POT1-RH1 D145G diminuiu os níveis de fragilidade telomérica nestas linhas celulares telomerase-positivas. Estes resultados sugerem, assim, que os telR-loops sustentam a proteção contra a instabilidade telomérica, e que esta função se torna determinante para a manutenção dos telómeros em fibroblastos primários humanos. Nas células que expressam telomerase, a perda de telómeros parece ser compensada pela presença desta enzima, que estabiliza a erosão progressiva das extremidades dos cromossomas lineares e suporta a homeostase telomérica. Como tal, e de acordo com as descrições associadas à natureza recombinante dos telómeros de células ALT e de levedura telomerase-negativas, propomos que os telR-loops também estimulam a extensão telomérica de uma maneira dependente de HDR em telómeros humanos curtos e danificados, de forma a adiar a ocorrência prematura de senescência e morte celular descontrolada. Adicionalmente, os nossos resultados sugerem que a RNase H1 pode funcionar como um fator limitante de recombinação telomérica nestas células ao regular os níveis de telR-loops e assegurar um equilíbrio entre senescência, supressão tumoral e estabilidade telomérica ao longo do ciclo de vida celular. Finalmente, os nossos resultados indicam também que o HDR telomérico pode ser exercido através de replicação induzida por quebras (BIR, do inglês Break-Induced Replication), tal como já foi verificado na manutenção de telómeros dependentes de HDR em células eucariotas que não expressam telomerase.Telomeres are heterochromatic nucleoprotein structures that protect the ends of eukaryotic linear chromosomes. In mammals, their core complex comprises tandem arrays of DNA duplex repeats (5’-TTAGGG-3’), from which the G-rich strand extends beyond its complement to form an overhang (G overhang), and a multiprotein complex known as “shelterin” that ensures proper telomere protection, integrity and length regulation. Telomeres are also transcribed into long noncoding RNA molecules known as TElomeric Repeat containing RNA (TERRA). Although a full characterization of TERRA functions is lacking, accumulating data show that it stimulates telomere protection/replication and heterochromatin formation. Additionally, TERRA is seen as a fine regulator of telomerase, since it promotes telomerase-mediated telomere elongation in vivo, but telomerase inhibition in vitro. TERRA can hybridize with its template substrate in both yeast and humans and form a three-stranded structure composed of an RNA-DNA hybrid and a displaced DNA strand, which is defined as a telomeric R-loop (telR-loop). We recently proved that TERRA functions might be partly mediated by the formation of telR-loops stimulated by TRF2. Furthermore, additional observations in telomerase-negative, pre-senescent yeast cells and alternative lengthening of telomeres (ALT)-positive tumors have implicated telR-loops in the promotion of homology-directed repair (HDR)-dependent telomere elongation to partially compensate for the erosion of chromosome ends in the absence of telomerase. TelR-loops are restricted by the RNase H1 and RNase H2 enzymes, which specifically hydrolyze the RNA moiety of RNA-DNA hybrids. While the accumulation of telR-loops in yeast cells lacking both enzymes delays senescence onset by promoting telomeric HDR, telR-loop depletion by RNase H1 overexpression leads to weakened recombination and, consequently, to telomere shortening and premature senescence. This study aims to better understand the importance of telR-loops in maintaining telomere stability in telomerase-positive and negative human cells and characterize how telR-loops support TERRA-mediated telomere length regulation. For this purpose, we established a cellular system based on telomere targeting of the catalytic domain of RNase H1 via fusion to the shelterin protein POT1. This system was employed for the specific removal of telR-loops in a telomerase-positive fibrosarcoma cell line (HT1080), primary human lung fibroblasts (HLF), and in HLF cells immortalized by overexpressing the telomerase reverse transcriptase subunit of human telomerase (HLF-hTERT). We discovered that telR-loop degradation, as a consequence of the exogenous expression of RNase H1 from our system, compromises telomere integrity in all the tested cell lines, as shown by the accumulation of DNA damage markers at telomeres 48 hours after telR-loop removal. Moreover, RNase H1 targeting to telomeres causes telomere loss in telomerase-negative HLF cells, but not in telomerase-positive HT1080 and HLF-hTERT cells. Altogether, these results suggest that telR-loops have a protective function against telomere instability, most prominently in primary human fibroblasts. Given the previous work detailing the recombinogenic nature of ALT and telomerase-negative yeast telomeres, we propose that telR-loops stimulate telomere elongation in an HDR-dependent manner at shortened telomeres to delay premature senescence and uncontrolled cell death.Com o patrocínio do CMAzzalin Lab, do Instituto de Medicina Molecular João Lobo Antunes (iMM) e Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa