Les cellules souches musculaires dérivées de la moelle osseuse (mise en évidence et étude de l'impact thérapeutique)

Nous avons utilisé un modèle murin de reconstitution médullaire à l'aide de moelle osseuse de souris transgéniques exprimant la protéine GFP " green fluorescent protein ". La protéine fluorescente GFP sert de marqueur pour les cellules du donneur dans les tissus du receveur. Grâce à ce modèle, nous avons montré qu'il existe des cellules, provenant de la moelle osseuse, (i) en position interstitielle exprimant des marqueurs de cellules souches (ii) en position satellite exprimant des marqueurs canoniques de cellules satellites et capables de fusionner pour donner des fibres musculaires. Ces fibres GFP+ sont plus nombreuses, après la greffe, chez les souris mdx, déficientes en dystrophine. L'expression de la dystrophine, dans ces fibres GFP+, reste limitée au site de fusion alors que la GFP diffuse loin de celui Ces résultats suggèrent que les thérapies cellulaires pourraient, plus volontiers, être adaptées aux corrections de déficit en protéines solubles plutôt que membranaires.We used transplantation of green fluorescent bone marrow to irradiated mice. The green fluorescent protein serves as an unambiguous marker of donor cell in the recipient tissues. Using this procedure, we demonstrate bone marrow-derived cells (i) in interstitial location expressing stem cell markers (ii) in satellite cell niche expressing canonical markers of satellite cells and able to fuse to form muscle fibers. These GFP+ fibers are more numerous after bone-marrow transplantation, in mdx mice with dystrophin deficiency. Dystrophin expression, in GFP+ fibers, is restricted to the site of fusion whereas GFP diffuse far from it. These results suggest that cell therapy could be, in the future, more appropriate to correct soluble protein deficiency than membrane associated protein.PARIS12-CRETEIL BU Multidisc. (940282102) / SudocSudocFranceF

Subphénotypes de la maladie de Duchenne et caractérisation de la myofibrose dystrophique humaine et expérimentale

La dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) est la maladie neuromusculaire la plus fréquente de l'enfant. Son évolution progressive inexorable conduit habituellement au décès dans la troisième décade. La DMD constitue cependant une affection hétérogène pour la sévérité de l'atteinte musculaire, cognitive et cardiaque, et cette hétérogénéité n'est pas totalement expliquée par la localisation des mutations dans le gène de la dystrophine. Ma thèse comporte trois volets: (1) une analyse clinique multivariée d'une cohorte de DMD suivie à long terme qui nous a permis de définir 4 phénotypes distincts de DMD; (2) une étude de corrélation clinico-pathologique qui a identifié la fibrose endomysiale précoce comme seul facteur histologique prédictif de sévérité motrice; (3) la mise au point d'un modèle murin original de myofibrose dystrophique chez la souris mdx déficiente en dystrophine. 1- Étude multiparamétrique clinique. La saisie par la même équipe des données fonctionnelles musculaires, cardiaques, respiratoires et cognitives de 75 patients atteints de DMD (tous génotypés et présentant une absence complète de dystrophine musculaire), suivis pendant >10 ans, a permis d'établir un modèle multiparamétrique satisfaisant à deux dimensions principales, cognitive et motrice, et de définir 4 clusters phénotypiques : (i) DMD cognitive et motrice congénitale (20%), (ii) DMD classique (28%), (iii) DMD motrice pure modérée (22%), (iv) DMD motrice pure sévère (30%). La corrélation génotypephénotype était restreinte à la seule atteinte cognitive. Des indicateurs pronostics précoce ont été identifiés et validés sur une 2ème série de 34 patients. 2- Étude histopathologique. Les variations de sévérité de l'atteinte musculaire n'étant pas expliquées par la génétique moléculaire, nous avons cherché à corréler les paramètres moteurs et la biopsie musculaire prélevée dans le quadriceps à un stade précoce (3-7 ans) chez 25 patients (analyse stéréologique des images numérisées pour les paramètres élémentaires: nécrose/régénération, fibres hypercontractées, adipocytes, fibrose endomysiale et périmysiale). Seule la fibrose endomysiale était associée à un pronostic moteur défavorable (p6 at 8yrs" with "normal or borderline mental status" reliably assigned patients to group C (sensitivity: 1, specificity: 0.94). These early criteria were also predictive of "congenital DMD" and "moderate pure motor DMD" in series 2. In a second part, we included 25 steroid-free DMD patients in a multiparametric analysis plotting initial histological alterations in quadriceps muscle with 13 relevant clinical data collected by the same team over a long-term follow-up (mean>10yrs). Elementary histological parameters (fiber size, hypercontracted fibers, necrotic/basophilic fibers, edema, endomysial and perimysial fibrosis, and fatty degeneration) were assessed by morphometry. Endomysial fibrosis was the sole myopathological parameter significantly correlated with poor motor outcome, assessed by quadriceps muscle strength, manual muscle testing of upper and lower limbs at 10yrs, and age at ambulation loss (all p<0.002). Motor outcome and fibrosis were not correlated with genotype. Myofibers exhibited oxidative stress-induced protein alterations and became separated from capillaries by fibrosis, which was associated with both increase of CD206+ alternatively activated macrophages and relative decrease of CD56+ satellite cells (both p<0.0001). This study provides firm basis for antifibrotic therapeutic strategies in DMD, and supports the view that alternatively activated macrophages, known to inhibit myogenesis while promoting collagen-producing cell formation, play a key role in myofibrosis. In the third experimental part, experiments were conducted on mdx mice at 6-8 weeks of age. Fifteen micropunctures were made daily in the right tibialis anterior (TA) muscle with micropins used for entomology (150 m diameter) during 2 weeks. Our data suggest that repeated microinjuries of muscle deficient in dystrophin protein triggers a endomysial fibrotic process that stabilizes with time well associated with muscle strenght decrease. Endomysial fibrosis seems to be one of the target of therapy in DMD. This satisfactory model will be usefull to study the mechanisms of fibrosis process in dystrophin deficient muscle and to evaluate antifibrotic treatment.PARIS-EST-Université (770839901) / SudocPARIS12-Bib. électronique (940280011) / SudocSudocFranceF

Recherche translationnelle sur les dystrophies myotoniques (étude de biomarqueurs et mise en place d'un observatoire national pour les essais cliniques)

Pas de résumé françaisPas de résumé anglaisPARIS-EST-Université (770839901) / SudocPARIS12-Bib. électronique (940280011) / SudocSudocFranceF

Mise en évidence d'un rôle de support stromal du macrophage vis-à-vis des cellules précurseurs myogéniques

Le muscle strié squelettique adulte est capable de régénérer, grâce aux propriétés des cellules satellites, ou cellules précurseurs myogéniques (mpc). Au cours de la régénération musculaire, le processus myogénique est supporté par des signaux issus dune part des cellules stromales et d'autre part, des monocytes/macrophages recrutés à partir de la circulation sanguine. Nous avons étudié les interrelations entre les mpc et les monocytes/macrophages humains. L'observation de coupes histologiques de muscle humain normal montre que les cellules satellites sont à proximité immédiate des capillaires (environ 12 um). In vitro, nous avons montré que les mpc, dès leur sortie de quiescence, attirent spécifiquement et préférentiellement les monocytes circulants. Nous avons identifié 5 facteurs chimiotactiques qui participent pour 77% du chimiotactisme : MP-derived chemokine (MDC), monocyte chemoattractant proteine-1 (MCP-1), fractalkine (FKN), VEGF et le système de l'urokinase. L'étude des contacts cellule:cellule entre les mpc et les macrophages nous a permis de montrer que les macrophages stimulent la prolifération des mpc par des facteurs solubles et inhibent leur apoptose par des contacts directs cellule:cellule impliquant les couples moléculaires fractalkine/CX3CR1 et VCAM-1 NLA-4. In vivo, dans les thérapies cellulaires réparatrices de l'infarctus du myocarde, les macrophages améliorent la survie des mpc implantées et semblent faciliter la migration des cellules myogéniques dans le tissu myocardique.Adult skeletal muscle s able to regenerate affer injury, through the property of satellite cells, or myogenic precursor cells (mpc). During muscle regeneration, myogenic process is supported by signaIs from stromal cells and monocytes/macrophages. We studied the relationship between human mpc and monocytes/macrophages. Normal human muscle histological observation shows that satellite cells are very close to capillaries (about 12 pm). In vitro, we showed that as soon as their exit of quiescence, mpc specifically and preferentialy attract circulating monocytes. We identified 5 chemotactic factors which are responsible for 77 % of monocytes chemotaxis: MP-derived chemokine (MDC), monocyte chemoattractant proteine-1 (MCP-1), fractalkine (FKN), VEGF and urokinase system. Study of ceIl:cell contacts between mpc and macrophages permit us to show that macrophages stimulate mpc proliferation by soluble factors and inhibit their apoptosis by direct celI:cell contacts involving fractalkine/CX3CRl and VCAM-1/VLA-4 molecular couples. In vivo, in muscle cell transplant to repair experimental heart injury, macrophages improve survival of implanted mpc and seems facilitate myogenic cells migration in the myocardic tissue. Thus, macrophage seems to be a stromal support for mpc in vitro et in vivo.PARIS12-CRETEIL BU Multidisc. (940282102) / SudocSudocFranceF

Immunité cellulaire TCD8 au cours de la neuronopathie paranéoplastique anti-Hu (étude de la protéine HuD comme antigène-candidat de la réponse immune cytotoxique)

PARIS12-CRETEIL BU Multidisc. (940282102) / SudocSudocFranceF

Biopersistence and Brain Translocation of Aluminum Adjuvants of Vaccines

Aluminum oxyhydroxide (alum) is a crystaline compound widely used as an immunologic adjuvant of vaccines. Concerns linked to the use of alum particles emerged following recognition of their causative role in the so-called macrophagic myofasciitis (MMF) lesion detected in patients with myalgic encephalomyelitis/chronic fatigue/syndrome. MMF revealed an unexpectedly long-lasting biopersistence of alum within immune cells in presumably susceptible individuals, stressing the previous fundamental misconception of its biodisposition. We previously showed that poorly biodegradable aluminum-coated particles injected into muscle are promptly phagocytozed in muscle and the draining lymph nodes, and can disseminate within phagocytic cells throughout the body and slowly accumulate in brain. This strongly suggests that long-term adjuvant biopersistence within phagocytic cells is a prerequisite for slow brain translocation and delayed neurotoxicity. The understanding of basic mechanisms of particle biopersistence and brain translocation represents a major health challenge, since it could help to define susceptibility factors to develop chronic neurotoxic damage. Biopersistence of alum may be linked to its lysosome-destabilizing effect, which is likely due to direct crystal-induced rupture of phagolysosomal membranes. Macrophages that continuously perceive foreign particles in their cytosol will likely reiterate, with variable interindividual efficiency, a dedicated form of autophagy (xenophagy) until they dispose of alien materials. Successful compartmentalization of particles within double membrane autophagosomes and subsequent fusion with repaired and re-acidified lysosomes will expose alum to lysosomal acidic pH, the sole factor that can solubilize alum particles. Brain translocation of alum particles is linked to a Trojan horse mechanism previously described for infectious particles (HIV, HCV), that obeys to CCL2 signaling the major inflammatory monocyte chemoattractant