The Method “cut cylinder” for Approximation Round and Cylindrical Shape Objects and Its Comparison with Other Methods

A method has been developed to approximate the volumes of cylindrical objects by slices. The method is based on an algebraic formula of circle. It allows to determine the thickness by width of the cylindrical object measured on the current and subsequent slices, which enables the morphometry of histological sections made with unequal pitch. The ‘‘cut cylinder’’ method is compared with other popular approximation methods: unilateral rectangles, trapezoids and reconstructions in the Amira software. A theoretical comparison of approximation methods revealed that an error of less than 5% can be achieved for the unilateral rectangle method with more than 11, and for the trapezoids’ method more than 6 slices. The ‘‘cut cylinder’’ algorithm allows to reproduce the contour of the cylindrical object in the most accurate way with a smaller number of slices - less than 6. In practical application of methods for round objects reconstructed by 6 histological sections with the equal pitch, the method of approximation by trapezoids gives a more accurate results and is easy to apply. In order to determine the thickness of the slice, the trapezoids’ method can be supplemented by a “cut cylinder” method, which contains a formula for determining the thickness of the slice by the width. The developed “cut cylinder” method allows to obtain data comparable to 3D-reconstruction in the Amira software (FEI, USA), however with a large dispersion for sections with equal pitch. #CSOC1120. © 2020, The Editor(s) (if applicable) and The Author(s), under exclusive license to Springer Nature Switzerland AG

Характеристика иммунофенотипа резидентных макрофагов печени и профиля экспрессируемых генов

The profile of the expressed genes, phenotype and phagocytic activity of resident macrophages of the liver were studied. It was found that most of the resident liver macrophages were F4/80+, CD68+, CD163+, and CD11b-. Induction of М2 factor phenotypes increased CD86 expression as well as triggered КІ67 expression. After activation of Ml and М2 by inducers, resident liver macrophages enhanced the expression of main anti-inflammatory cytokines. Resident liver macrophages showed pronounced phagocytic activity, which faded up to 5 hours after the administration of latex particles, but the addition of inducers of both the Ml and М2 phenotype stimulated phagocytosis during 24 hours.Изучены профиль экспрессируемых генов цитокинов и маркеров макрофагов, фенотип и фагоцитарная активность резидентных макрофагов печени. Обнаружено, что большая часть резидентных макрофагов печени имела фенотип F4/80+, CD68+, CD163+, CD lib". Воздействие факторов, поляризующих макрофаги в направлении М2-фенотипа, приводило к повышению экспрессии CD86 и появлению экспрессии КІ67. После активации M1 и М2 индукторами у резидентных макрофагов печени повышалась экспрессия в основном противовоспалительных цитокинов. Резидентные макрофаги печени обладали выраженной фагоцитарной активностью, которая снижалась к 5 часам, однако добавление индукторов как M1, так и М2 фенотипа стимулировало фагоцитоз до 24 часов после внесения латексных частиц

Expression of Metalloproteinases and Type I and III Collagens during Healing of Excisional Skin Wound on the Abdomen and Back in Rats

The study was carried out using a novel rat model developed in our laboratory, namely16 mm diameter circular excisional wounds were generated on the abdomen which resulted in minimal scarring. Restoration of the skin integrity was completed by day 60 after the wounding surgery. By this time, regenerates on the abdomen were stronger than on the back (at, respectively, 58 and 17.4 % of the tensile strength of the intact skin at corresponding location) and the ratio of type I and type III collagens in regenerates on the abdomen reached the level of intact skin at the same location. On days 3 to 14, the ratio of Mmp9/Timp1 expression levels on the abdomen was higher than on the back. On days 20 and 30, the Mmp9/Timp1 ratio on the abdomen was identical to the level of intact skin, whereas the increased MMPs expression levels on the back were maintained until day 30. It has been shown for the first time that according to functional and molecular characteristics, wound healing on the abdomen of an adult rat is more similar to complete regeneration than scarring repair of the back skin. © 2020, Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature

РЕГУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАЦИИ ГЕПАТОЦИТОВ ПОСЛЕ СУБТОТАЛЬНОЙ РЕЗЕКЦИИ ПЕЧЕНИ КРЫС

Hepatocyte proliferation is the main cellular mechanism of liver regeneration. However, after removal of more than 80 % of the liver mass, a temporary block of hepatocyte proliferation is observed, which may be the cause of impaired regeneration during transplantation and liver resection in the clinical practice. The current study aims to analyze the molecular mechanisms of hepatocyte proliferation impairment after subtotal liver resection in rats. In male Wistar rats, a model of liver regeneration after subtotal resection is reproduced — removal of more than 80 % of liver mass. Using the methods of immunohistochemistry, PCR-RT, western blot, possible molecular mechanisms of slowing down the proliferation of hepatocytes were studied. It was found that expression of cyclin D1 and E increased only 30 hours after surgery. Their appearance coincides with the beginning of transcription of genes for Cyclins D1 and E1 at 30 h after surgery. The corresponding increase in concentrations of cyclin D 1 and E proteins is further delayed till 48 h after surgery. These results indicate that, in this particular model, hepatocytes are reluctant to undergo transition between G 0 -and G 1 -phases of cell cycle. We have observed a prolonged decrease in the expression of proto-oncogene C-met (the hepatocyte growth factor receptor-encoding gene Met). We have also observed an increase in expression of the transforming growth factor beta-1 receptor-encoding gene TgfbrII. At the same time, irreversible block of hepatocyte proliferation was prevented by expression of certain factors, notably of the TWEAK/ Fn14 signaling pathway: concentrations of the corresponding proteins in remnant livers have peaked from 24 h to 48 h after surgery. Thus, after subtotal liver resection, the remaining hepatocytes are exposed to a large scope of both mitogenic and antimitogenic factors. Proliferative behavior of hepatocytes in remnant livers is determined by fine balance of these factors. The prevalence of antimitogenic factors in the early period after surgery delays the onset of hepatocyte proliferation. © 2018, Human Stem Cell Institute. All rights reserved.Пролиферация гепатоцитов является основным клеточным механизмом регенерации печени. Однако после удаления более 80 % объема печени наблюдается временный блок их пролиферации, который может являться причиной нарушения регенерации при трансплантации и резекции органа в клинической практике. Цель настоящего исследования - проанализировать молекулярные механизмы нарушения пролиферации гепатоцитов после субтотальной резекции печени у крыс. У самцов крыс породы Вистар воспроизведена модель регенерации печени после субтотальной резекции - удаление более 80 % объема печени. С помощью методов иммуногистохимии, ПЦР-РВ и вестерн-блота были изучены возможные молекулярные механизмы замедления вступления гепатоцитов в пролиферацию. Установлено, что экспрессия генов, кодирующих белки циклин D1 и Е, увеличивается через 30 ч., а увеличение содержания соответствующих белков происходит через 48 ч. после операции, на основании чего можно сделать вывод о том, что после резекции нарушен переход гепатоцитов из G0- в G1,-фазу митотического цикла. Также выявлено, что после операции отмечается длительный период сниженной экспрессии гена C-met (с 12 до 48 ч.), а также низкая концентрация HGF в печени (через 2, 3 и 7 сут.). Обнаружено повышение экспрессии соответствующего гена рецептора TGFb, - TgfbrII (через 6 и 30 ч. после операции). Указанные особенности репаративного процесса после субтотальной резекции могут стать причиной замедленного вступления гепатоцитов в G1-фазу митотического цикла. Необратимому блоку пролиферации гепатоцитов препятствует активация экспрессии ряда факторов, в том числе TWEAK/Fn14-сигнального пути: наибольшее количество соответствующих белков обнаружено через 24-48 ч. после субтотальной резекции. Таким образом, в исследованной модели гепатоциты находятся под влиянием большого спектра как промитогенных, так и антимитогенных факторов. Смещение равновесия в ту или иную сторону и определяет судьбу гепатоцитов. В раннем периоде после субтотальной резекции преобладают антимитогенные факторы, что приводит к замедлению вступления гепатоцитов в пролиферацию

Экспрессия металлопротеиназ и коллагенов I и III типов при заживлении кожной раны на животе и спине крыс

The study was carried out using a novel rat model developed in our laboratory, namely16 mm diameter circular excisional wounds were generated on the abdomen which resulted in minimal scarring. Restoration of the skin integrity was completed by day 60 after the wounding surgery. By this time, regenerates on the abdomen were stronger than on the back (at, respectively, 58 % and 17.4 % of the tensile strength of the intact skin at corresponding location) and the ratio of type I and type III collagens in regenerates on the abdomen reached the level of intact skin at the same location. On days 3 to 14, the ratio of Mmp9/Timp1 expression levels on the abdomen was higher than on the back. On days 20 and 30, the Mmp9/Timp1 ratio on the abdomen was identical to the level of intact skin, whereas the increased metalloproteinase expression levels on the back were maintained until day 30. It has been shown for the first time that according to functional and molecular characteristics, wound healing on the abdomen of an adult rat is more similar to complete regeneration than scarring repair of the back skin.Исследование проведено на новой разработанной нами модели заживления кожи после эксцизионной раны диаметром 16 мм на животе крысы с образованием минимального рубца в сравнении с общеизвестной моделью раны на спине. Показано восстановление прочностных характеристик кожи к 60-м суткам после повреждения: на животе регенерат прочнее (58% прочности на разрыв от интактного контроля), чем на спине (17.4% от контроля), а соотношение коллагена I и коллагена III на животе достигает уровня в интактной коже. При этом с 3-х по 14-е сутки соотношение уровней экспрессии Mmp9 / Timp1 в коже живота было выше, чем после аналогичной травмы кожи спины, на 20-е и 30-е сутки уже не отличалось от интактной кожи, в то время как в ране спины вплоть до 30-х суток наблюдали повышенный уровень экспрессии металлопротеиназ. Показано, что заживление раны на животе взрослой крысы по функциональным и молекулярным характеристикам ближе к полноценной регенерации, чем рубцовая репарация кожи спины

Анализ экспрессии генов-регуляторов воспаления клеток Купфера и моноцитов

It has been established that resident macrophages using the example of Kupffer cells and monocytes differ in the profile of expressed genes. The observed differences in gene expression profiles do not allow to consider the resident liver macrophages as purely M2 macrophages or monocytes as purely M1 macrophages. At the same time, a significant proportion of the genes upregulated in Kupffer cells are associated with the normal regulation of liver functions (Arg 1, Flt, iNOs, Kng). In monocytes, a number of genes upregulated in comparison with Kupffer cells include Alox15, Alox12, and Toll-like receptor-encoding genes Tlr2, Tlr4, Tlr7, Tlr8. These represent typical functional genes of macrophages, which supports the view of monocytes as highly specialized blood macrophages.Установлено, что резидентные макрофаги на примере клеток Купфера и моноциты различаются по профилю экспрессируемых генов. Однако это не позволяет отнести однозначно резидентные макрофаги печени к М2-макрофагам, а моноциты - к клеткам с М1-фенотипом. При этом у клеток Купфера обнаружено значительное количество генов с повышенной экспрессией, которые связаны с регуляцией функций печени в норме: Arg1 , Flt , iNos , Kng1 . У моноцитов также обнаружено большое число генов с повышенной по сравнению с клетками Купфера экспрессией: Alox15 , Alox12 , Tlr2 , Tlr4 , Tlr7 , Tlr8 , которые относятся к типичным функциональным генам макрофагов

Характеристика иммунофенотипа резидентных макрофагов печени и профиля экспрессируемых генов

The profile of the expressed genes, phenotype and phagocytic activity of resident macrophages of the liver were studied. It was found that most of the resident liver macrophages were F4/80+, CD68+, CD163+, and CD11b-. Induction of М2 factor phenotypes increased CD86 expression as well as triggered КІ67 expression. After activation of Ml and М2 by inducers, resident liver macrophages enhanced the expression of main anti-inflammatory cytokines. Resident liver macrophages showed pronounced phagocytic activity, which faded up to 5 hours after the administration of latex particles, but the addition of inducers of both the Ml and М2 phenotype stimulated phagocytosis during 24 hours.Изучены профиль экспрессируемых генов цитокинов и маркеров макрофагов, фенотип и фагоцитарная активность резидентных макрофагов печени. Обнаружено, что большая часть резидентных макрофагов печени имела фенотип F4/80+, CD68+, CD163+, CD lib". Воздействие факторов, поляризующих макрофаги в направлении М2-фенотипа, приводило к повышению экспрессии CD86 и появлению экспрессии КІ67. После активации M1 и М2 индукторами у резидентных макрофагов печени повышалась экспрессия в основном противовоспалительных цитокинов. Резидентные макрофаги печени обладали выраженной фагоцитарной активностью, которая снижалась к 5 часам, однако добавление индукторов как M1, так и М2 фенотипа стимулировало фагоцитоз до 24 часов после внесения латексных частиц

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МАКРОФАГОВ ЭМБРИОНАЛЬНОГО И МОНОЦИТАРНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Macrophages of mammals are a heterogeneous population of cells. This applies both to the functional parameters of macrophages and to the sources of their development. The comparative characteristics of macrophages of embryonic origin on the example of Kupffer cells and macrophages of bone marrow origin on the example of macrophages of monocyte derivatives were carried out. Cultures of Kupffer cells and macrophages of monocytic origin were obtained. The phenotype, profile of gene expression of native macrophages activated in direction M1 and M2 was studied. The phenotype of isolated cultures is characterized by methods of immunocytochemistry, flow cytometry. Gene expression was studied by real-time polymerase chain reaction. Under the influence of inducing factors, the phenotype of two populations of macrophages changes in a similar way: under the influence of M1-factors, the synthesis of CD86 and iNOs is activated in cells, under the influence of M2 - CD163 and Arg1. In Kupffer cells, expression of anti-inflammatory cytokines - il4, il13, is more pronounced, and in macrophages of monocytic origin of pro-inflammatory cytokines - il1b, tnfa, il12a. The induction of the genes of proinflammatory cytokines in Kupffer cells is slower compared to macrophages of monocytic origin. © 2018 Human Stem Cell Institute. All rights reserved.Макрофаги млекопитающих представляют собой гетерогенную популяцию клеток, различия касаются как источников их происхождения, так и функциональных показателей. В работе проведена сравнительная характеристика макрофагов эмбрионального происхождения на примере клеток Купфера и макрофагов костномозгового происхождения на примере макрофагов - производных моноцитов. Из печени крыс была получена культура клеток Купфера, из крови крыс - макрофаги моноцитарного происхождения. Оценивали фенотип и профиль экспрессии генов нативных и активированных в направлении М1- и М2-макрофагов. Фенотип выделенных культур был охарактеризован с помощью методов иммуноцитохимии и проточной цитофлуориметрии. Экспрессию генов изучали с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени. Под влиянием индуцирующих факторов фенотип двух популяций макрофагов изменяется сходным образом: под влиянием М1 факторов в клетках активизируется синтез CD86 и iNOs, под влиянием М2 - CD163 и Arg1. В клетках Купфера более выражена экспрессия генов противовоспалительных цитокинов - il4, il13, а в макрофагах моноцитарного происхождения экспрессия генов провоспалительных цитокинов - il1b, tnfa, il12a. Индукция генов провоспалительных цитокинов в клетках Купфера происходит медленнее по сравнению с макрофагами моноцитарного происхождения

Analysis of the Expression of Regulator Genes in Kupffer Cells and Monocytes

Differences in the gene expression profiles in resident macrophages (in particular, Kupffer cells) and monocytes were revealed. However, these differences in gene expression profiles do not allow considering resident liver macrophages as purely M2 macrophages and monocytes as purely M1 macrophages. At the same time, a significant number of the genes upregulated in Kupffer cells are associated with normal regulation of liver functions (Arg 1, Flt, iNOs, and Kng). In monocytes, the expression of genes Alox15, Alox12, Tlr2, Tlr4, Tlr7, and Tlr8 (typical functional genes of macrophages) was also upregulated in comparison with Kupffer cells. © 2020, Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature

Understanding mechanisms of the umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cell-mediated recovery enhancement in rat model of limb ischemia

Umbilical cord-derived multipotent mesenchymal stromal cells (UC-MMSCs) are considered as a strong candidate for cell therapy of lower limb ischemia. Sustained calf muscle ischemia with aseptic inflammatory response was induced in Sprague-Dawley rats by excision of femoral and popliteal arteries. UC-MSCs were injected into the calf muscle on day 7 after surgery. The animals were sacrificed on days 3, 10, and 30 after transplantation. Animals responded to the transplantation by temporary improvement in their locomotor function as assessed by the rota-rod performance test. Measured size of the lesions was significantly smaller in the experimental group than in the control group at all time points throughout the observation. The transplantation stimulated angiogenic processes on day 10 after transplantation. Living transplanted cells were traced for up to 30 days after transplantation, during which time they migrated to the damaged area to be partially eliminated by host macrophages; none of them differentiated into endothelial or smooth muscle cells of blood vessels. Additionally, the transplantation led to the predominance of activated pro-angiogenic and anti-inflammatory M2 macrophages by inhibiting the CD68+ macrophage infiltration and stimulating the CD206+ macrophage activation at the site of injury. A single intramuscular injection of allogeneic umbilical cord-derived mesenchymal stromal cells reproducibly facilitated recovery of structural and functional properties of surgically ischemized calf muscles in a rat. No differentiation of the transplanted cells in vivo was observed. The transplantation negatively regulated inflammation and enhanced tissue repair chiefly by modulating local patterns of macrophage activation. © 2018 Human Stem Cell Institute. All rights reserved