Unterschiedliche Funktionen von Syntaxin-1 im neuronalen Überleben, synaptisches Vesikelandocken und Vesikelfusion in Mausneuronen

Neurons relay information via neurotransmitter release through the fusion of the neurotransmitter filled presynaptic vesicles with the plasma membrane mediated by the sophisticated interplays of presynaptic proteins. Syntaxin-1 (Stx1) is one of the core elements of this vesicular release machinery. As a member of the soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) protein family, it essentially functions in vesicle fusion, and in the prior preparatory steps, the vesicle docking, and priming. Knock- out studies in mammalian systems addressing Stx1’s functions in neurotransmission has been complicated by the functional redundancy between the two isoforms Stx1A, and Stx1B, and by the embryonic lethality in the absence of both isoforms. In this project, we aimed to circumvent these complications to investigate the roles of Stx1 in neurotransmitter release, and in neuronal maintenance, and generated two Stx1A/1B double knock-out (DKO) mouse models: 1) The constitutive Stx1A/1B DKO mice exhibited a widespread neuronal loss throughout the whole brain at embryonic day (E) 16 progressing towards E18. The cultured cortical neurons from E16 Stx1A/1B DKO mice were also severely lethal as almost no neurons remained alive at day in vitro 4. Comparison with the lethality of Munc18-1 null neurons in the same culture conditions manifested a higher dependence of neuronal maintenance on Stx1 than on Munc18-1. 2) The conditional deletion of Stx1B via Cre/LoxP system on an Stx1A null background (Stx1A/1B cDKO) revealed a perpetual requirement of Stx1 for neuronal survival as the deletion of Stx1 in mature neurons ultimately caused neuronal death. Additionally, neurotransmitter release measurements by electrophysiological recordings and presynaptic ultrastructural analysis by electron microscopy showed a complete inhibition of vesicle priming and fusion, and a severe impairment in vesicle docking in the dissociated hippocampal Stx1A/1B cDKO neurons. Lentiviral expression of a Stx1A mutant (A240V, V244A) in Stx1A/1B cDKO neurons rescued the neuronal survival but not the vesicle fusion and priming implying distinct functions of Stx1 in neuronal maintenance and neurotransmitter release. Strikingly, this mutant restored vesicle docking, which indicates a further distinction between the functions of Stx1 in vesicle docking and fusion. Future studies will focus on structure- function analysis of Stx1 in neuronal maintenance and neurotransmitter release by utilizing lentiviral expression of Stx1 mutants in Stx1A/1B cDKO mouse neurons. Such a detailed analysis of the functions of Stx1’s different domains in vesicle docking, priming, and fusion would enhance our understanding of the intricate mechanisms underlying neurotransmission. Moreover, discovery of the pathways involving Stx1 with a function in neuronal maintenance would shed light onto the interdependence of neurodegeneration and synaptic functions.Neurone übermitteln Information/Reize untereinander durch die Freisetzung von Neurotransmittern, die durch die Fusion von mit Neurotransmittern gefüllten präsynaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran geschieht. Dieser elementare Prozess wird durch ein komplexes Zusammenspiel präsynaptischer Proteine reguliert. Syntaxin-1 (Stx1) ist eines der Kernbestandteile dieses vesikulären Proteinapparates. Als ein Teil der soluble N- ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor (SNARE) Proteinfamilie wirkt es bei der Vesikelfusion, sowie in den vorangehenden Vorbereitungsschritten, dem Andocken und Priming mit. Knock-out Analyse der Funktionen von Stx1 in der Neurotransmitterfreisetzung wurde durch die kompensatorischen Effekte der zwei neuralen Isoformen Stx1A und Stx1B und durch embryonische Letalität in Abwesenheit beider Isoforme erschwert. Bestreben dieses Projektes war es daher, diese Komplikationen zu umgehen und die Funktionen von Stx1 in der Neurotransmitterfreisetzung als auch im neuronalen Überleben zu untersuchen. Zu diesem Zweck haben wir zwei Double-Knock-out (DKO) Mausmodelle generiert. 1) Konstitutive Stx1A/1B DKO Mäuse zeigten ein gehirnweites Absterben der Neurone mit einer progressiven Schwere vom embryonalen Tag (E) 16 bis zu E18. Auch das Überleben kultivierter kortikaler Neurone von E16 Stx1A/1B DKO Mäusen zeigte sich stark kompromittiert, fast keine Neurone haben bis Tag 4 in vitro (DIV) überlebt. Ein direkter Vergleich des Verlustes von Munc18-1 und Stx1 unter den gleichen Zellkulturkonditionen zeigte eine größere Abhängigkeit des neuronalen Erhalts von Stx1 als von Munc18-1. 2) Die konditionale Deletion von Stx1B mithilfe des Cre/LoxP-Systems bei einem null Hintergrund von Stx1A (Stx1A/1B cDKO) zeigte eine lebenslängliche Notwendigkeit von Stx1 für das neuronale Überleben, da die Deletion von Stx1 in reifen Neuronen zum Zelltod führte. Außerdem konnten mit elektrophysiologischen Messungen der Neurotransmitterfreisetzung und mit Ultrastrukturanalyse der synaptischen Kompartimente durch Elektron enmikroskopie eine komplette Hemmung der Vesikelfusion und des Vesikelprimings, sowie schwere Beeinträchtigungen des Vesikelandockens in dissoziierten hippokampalen Neuronen gezeigt werden. Lentivirale Expression eines Stx1A-Mutanten (A240V, V244A) konnte das neuronale Überleben, jedoch nicht die Vesikelfusion oder das Vesikelpriming retten. Dies deutet auf verschiedene Funktionen von Stx1 im neuronalen Erhalt und in der Neurotransmitterfreisetzung hin. Erstaunlicherweise stellte dieser Mutant auch die angedockten Vesikel wieder her, was einen weiteren Unterschied in den Funktionen von Stx1 im Vesikelandocken und in der Vesikelfusion offenbart. Zukünftige Studien werden sich auf die Struktur-Funktionsanalyse von Stx1 in Bezug auf neuronalen Erhalt und Neurotransmitterfreisetzung durch Nutzung lentiviraler Expression von Stx1-Mutanten in Stx1A/1B cDKO Mausneuronen konzentrieren. Eine solch detaillierte Analyse der Funktionen der verschiedenen Domänen von Stx1 im Vesikelandocken, Priming und der Fusion würde unser Verständnis der komplexen Mechanismen, die der Neurotransmitterfreisetzung zugrundeliegen, fördern. Gleichzeitig würde Erkenntnis über die Pathways (?), die Stx1 mit einer Funktion in neuronale Überleben wichtig sind, Aufschluss über die Wechselseitige Abhängigkeit von Neurodegeneration und synaptischen Funktionen geben

RIM-binding protein 2 regulates release probability by fine-tuning calcium channel localization at murine hippocampal synapses

The tight spatial coupling of synaptic vesicles and voltage-gated Ca2+ channels (CaVs) ensures efficient action potential-triggered neurotransmitter release from presynaptic active zones (AZs). Rab-interacting molecule-binding proteins (RIM-BPs) interact with Ca2+ channels and via RIM with other components of the release machinery. Although human RIM-BPs have been implicated in autism spectrum disorders, little is known about the role of mammalian RIM-BPs in synaptic transmission. We investigated RIM-BP2-deficient murine hippocampal neurons in cultures and slices. Short-term facilitation is significantly enhanced in both model systems. Detailed analysis in culture revealed a reduction in initial release probability, which presumably underlies the increased short-term facilitation. Superresolution microscopy revealed an impairment in CaV2.1 clustering at AZs, which likely alters Ca2+ nanodomains at release sites and thereby affects release probability. Additional deletion of RIM-BP1 does not exacerbate the phenotype, indicating that RIM-BP2 is the dominating RIM-BP isoform at these synapses