Autorregulação da biodisponibilidade do óxido nítrico em plantas : mecanismos moleculares e relação com o processo de assimilação de nitrato

Orientador: Ione SalgadoTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: Este trabalho de Tese avalia mecanismos moleculares envolvidos na ação sinalizadora do radical óxido nítrico (NO) e sua relação com o controle da assimilação de nitrato na planta modelo Arabidopsis thaliana. Os objetivos desta Tese foram atingidos através do cultivo de plantas de A. thaliana selvagem e mutantes cognatos em condições controladas de disponibilidade de nutrientes, seguido da análise de expressão gênica por qPCR, determinação de atividades enzimáticas e conteúdo de metabólitos por espectro e fluorimetria e fracionamento de metabólitos por HPLC, bem como construção de transgênicos de interesse e análise de modificação pós traducional de proteína. No Capítulo I desta Tese apresento uma abrangente revisão científica publicada no periódico Brazilian Journal of Botany (DOI: 10.1007/s40415-013-0013-6) na qual mecanismos estabelecidos de produção, degradação e sinalização do NO são detalhados. Neste capítulo há um breve levantamento histórico sobre a compreensão científica da ação sinalizadora do radical NO em sistemas celulares e uma análise crítica e comparativa de como a homeostase deste radical é diferencialmente atingida em animais e plantas. Neste capítulo são introduzidas as informações necessárias no campo da sinalização redox mediada por NO que serviram de base para o desenvolvimento do trabalho experimental apresentado no capítulo a seguir. No Capítulo II apresento evidências experimentais originais de que a ação sinalizadora do radical NO em plantas impacta em sua própria degradação, através da regulação da atividade enzimática da GSNOR1, e síntese, através do processo de assimilação de nitrato. Este capítulo é apresentado conforme manuscrito publicado no periódico científico Nature Communications (DOI: 10.1038/ncomms6401). Neste trabalho mostramos que S-nitrosotióis suprimem a captação e redução do nitrato por transportadores e redutases específicos. Ainda, apresentamos um robusto conjunto de evidências que indica o controle da atividade enzimática da GSNOR1 através de uma S-nitrosilação inibitória. Concluímos, por tanto, que um novo mecanismo de autorregulação da biodisponibilidade do NO esteja envolvido na regulação da assimilação de nitrato em plantas e propomos um modelo que sumariza nossos achados. No Capítulo III apresento um texto submetido à publicação na forma de capítulo de livro no qual são analisados criticamente recentes avanços no campo da sinalização redox mediada por NO e do processo de assimilação de nitrato em plantas. Em especial, nossos achados experimentais são balizados em relação ao atual conhecimento científico, dessa forma podendo ser visto como uma extensão e aprofundamento à discussão apresentada no Capítulo II. Apresento neste capítulo uma detalhada descrição do processo de assimilação do nitrato e sua íntima associação à síntese e degradação do radical NO em plantas. Ao longo de todo o texto são destacados objetivos que considero promissores para o avanço de pesquisas na área de nutrição vegetal, em especial relacionadas à sinalização redox. Como contribuição científica desta Tese, propomos um novo mecanismo de autorregulação da biodisponibilidade do NO em plantas com relevante impacto no processo de assimilação de nitrato. Espero que essas novas propostas substanciem pesquisas e práticas agrícolas com o objetivo de aumentar a produção vegetal, mitigar perdas econômicas e reduzir a poluição ambiental causada pelo uso excessivo de fertilizantesAbstract: This Thesis assesses the molecular mechanisms involved in the nitric oxide (NO)-mediated redox signalling, with a focus on the control of the nitrate assimilation process in the model plant Arabidopsis thaliana. To achieve the objectives of this Thesis, wild-type A. thaliana plants and cognates mutants were cultivated under nutrient controlled conditions and subjected to gene expression analysis by qPCR technique, determination of enzyme activities and metabolite content by spectrometry and fluorimetry, and metabolite fractionation by HPLC, as well as construction of transgenic lines of interest and analysis of protein post-translational modification. In Chapter I of this Thesis is presented a comprehensive scientific review published in the Brazilian Journal of Botany (DOI: 10.1007/s40415-013-0013-6) in which the established mechanisms of NO production, scavenging and signalling are detailed. In this chapter it is briefly described how the NO perception in biological systems has evolved, as well as a critical and comparative review of how NO homeostasis is achieved between plants and animals. Importantly, in Chapter I, the background technical and scientific information concerning the NO-mediated redox signalling that supports the experimental work presented in the following chapter is introduced. Chapter II presents a set of original experimental evidence indicating that in plants NO-mediated redox signalling impacts its own scavenging, through the enzymatic regulation of GSNOR1, and synthesis, through the nitrate assimilatory process. This chapter is organized as published in the scientific journal Nature Communications (DOI: 10.1038/ncomms6401). We provide evidence that S-nitrothiols feedback regulate nitrate uptake and reduction. Additionally, we present a robust set of evidence that GSNOR1 is directly inhibited by NO through S-nitrosylation. We conclude that a novel mechanism of NO self-control of bioavailability is involved in the fine-tuning of nitrate assimilation in plants. We then propose a model that summarizes our findings. Chapter III contains a manuscript submitted for publication as a book chapter in which a critical review is presented of recent advances in the NO signalling field, together with that of research on the nitrate assimilatory process. Especially, our recent findings are discussed in face of current knowledge, so this chapter can be read as an extension of the discussion presented in Chapter II. Along Chapter III, a detailed description of the nitrate assimilatory process and its intimate interplay with NO synthesis and scavenging in pants can be found. Throughout the text is highlighted what I consider promising objectives to the scientific progress in the field of plant nutrition, specially related with the redox signalling. As a scientific contribution of this Thesis, we propose a novel molecular mechanism of NO control of its own bioavailability with a significant impact on the nitrate assimilatory process in plants. I expect these new proposals to substantiate scientific research and agriculture practices aiming to raise crop yield and mitigate economic and environmental losses due to the excessive use of fertilizersDoutoradoBioquimicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular2008/08931-8FAPES

Transcriptional regulation by complex interplay between posttranslational modifications

Transcriptional reprogramming in response to developmental changes or environmental inputs is regulated by a wide variety of transcription factors and cofactors. In plants, the stability of many transcriptional regulators is mediated by the ubiquitin-mediated proteasome. Recent reports suggest that additional post-translational modifications modulate the ubiquitination and thus stability of transcriptional regulators. In addition to well-recognized phosphorylative control, particularly conjugation to the ubiquitin-like protein SUMO as well as thiol modification by nitric oxide to yield S-nitrosothiols, are emerging as key regulatory steps for governing protein ubiquitination in the nucleus. Complex interplay between these different post-translational modifications may provide robust control mechanisms to fine tune developmental and stress-responsive transcriptional programs