Refinement of water-filtered infrared A (wIRA) irradiations of in vitro acute and persistent chlamydial infections.

Water-filtered infrared A (wIRA) alone or in combination with visible light (VIS) exerts anti-chlamydial effects in vitro and in vivo in acute infection models. However, it has remained unclear whether reduced irradiation duration and irradiance would still maintain anti-chlamydial efficacy. Furthermore, efficacy of this non-chemical treatment option against persistent (chronic) chlamydial infections has not been investigated to date. To address this knowledge gap, we evaluated 1) irradiation durations of 5, 15 or 30 min in genital and ocular Chlamydia trachomatis acute infection models, 2) irradiances of 100, 150 or 200 mW/cm2 in the acute genital infection model and 3) anti-chlamydial activity of wIRA and VIS against C. trachomatis serovar B and E with amoxicillin (AMX)- or interferon γ (IFN-γ)-induced persistence. Reduction of irradiation duration reduced anti-chlamydial efficacy. Irradiances of 150 to 200 mW/cm2, but not 100 mW/cm2, induced anti-chlamydial effects. For persistent infections, wIRA and VIS irradiation showed robust anti-chlamydial activity independent of the infection status (persistent or recovering), persistence inducer (AMX or IFN-γ) or chlamydial strain (serovar B or E). This study clarifies the requirement of 30 min irradiation duration and 150 mW/cm2 irradiance to induce significant anti-chlamydial effects in vitro, supports the use of irradiation in the wIRA and VIS spectrum as a promising non-chemical treatment for chlamydial infections and provides important information for follow-up in vivo studies. Notably, wIRA and VIS exert anti-chlamydial effects on persistent chlamydiae which are known to be refractory to antibiotic treatment

Refinement of water-filtered infrared A (wIRA) irradiations of in vitro acute and persistent chlamydial infections

Water-filtered infrared A (wIRA) alone or in combination with visible light (VIS) exerts anti-chlamydial effects in vitro and in vivo in acute infection models. However, it has remained unclear whether reduced irradiation duration and irradiance would still maintain anti-chlamydial efficacy. Furthermore, efficacy of this non-chemical treatment option against persistent (chronic) chlamydial infections has not been investigated to date. To address this knowledge gap, we evaluated 1) irradiation durations of 5, 15 or 30 min in genital and ocular Chlamydia trachomatis acute infection models, 2) irradiances of 100, 150 or 200 mW/cm2 in the acute genital infection model and 3) anti-chlamydial activity of wIRA and VIS against C. trachomatis serovar B and E with amoxicillin (AMX)- or interferon γ (IFN-γ)-induced persistence. Reduction of irradiation duration reduced anti-chlamydial efficacy. Irradiances of 150 to 200 mW/cm2, but not 100 mW/cm2, induced anti-chlamydial effects. For persistent infections, wIRA and VIS irradiation showed robust anti-chlamydial activity independent of the infection status (persistent or recovering), persistence inducer (AMX or IFN-γ) or chlamydial strain (serovar B or E). This study clarifies the requirement of 30 min irradiation duration and 150 mW/cm2 irradiance to induce significant anti-chlamydial effects in vitro, supports the use of irradiation in the wIRA and VIS spectrum as a promising non-chemical treatment for chlamydial infections and provides important information for follow-up in vivo studies. Notably, wIRA and VIS exert anti-chlamydial effects on persistent chlamydiae which are known to be refractory to antibiotic treatment

Effects of water-filtered infrared A and visible light (wIRA/VIS) radiation on heat- and stress-responsive proteins in the retina and cornea of guinea pigs

Water-filtered infrared A and visible light (wIRA/VIS), shown to reduce chlamydial infections in vitro and in vivo, might represent an innovative therapeutic approach against trachoma, a neglected tropical disease caused by ocular infection with the bacterium C. trachomatis. In this in vivo study, we assessed the impact of wIRA radiation in combination with VIS (wavelength range 595–1400 nm, intensity 2100 W/m2) on the retina and cornea in a guinea pig animal model of inclusion conjunctivitis. We investigated the effects 19 days after wIRA/VIS irradiation by comparing a single and double wIRA/VIS treatment with a sham control. By immunolabeling and western blot analyses of critical heat- and stress-responsive proteins, we could not detect wIRA/VIS-induced changes in their expression pattern. Also, immunolabeling of specific retinal marker proteins revealed no changes in their expression pattern caused by the treatment. Our preclinical study suggests wIRA/VIS as a promising and safe therapeutic tool to treat ocular chlamydial infections

Untersuchung der DNA-Schadensantwort in der murinen Retina nach ionisierender Strahlung

DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) können sowohl durch die Einwirkung ionisierender Strahlung als auch durch andere exogene und endogene Faktoren erzeugt werden. Die Reparatur von DSBs ist ein entscheidender Prozess zur Aufrechterhaltung der genomischen Integrität eines Organismus. Die zelluläre Schadensantwort auf DSBs, bei der es zur Phosphorylierungen von Histonen (z.B. H2AX) und zur Akkumulation von Signalproteinen (z.B. pATM und 53BP1) um den Bereich von DSBs kommt, kann Zelltyp-spezifische Unterschiede aufweisen. Darüber hinaus wurde in den letzten Jahren immer deutlicher, dass auch die Chromatinorganisation einen entscheidenden Einfluss auf die Erkennung und Reparatur von DSBs hat. In der vorliegenden Arbeit wurde die Schadenserkennung sowie die Reparatur von DSBs in der Retina der Maus untersucht, welche im adulten Stadium ein vergleichsweise einfach aufgebautes Gewebe mit einer geringen Anzahl an Zelltypen mit unterschiedlichen Chromatinstrukturen darstellt. Mit Hilfe der H2AX-Foci-Analyse und der Methode der Pulsfeldgelelektrophorese konnte festgestellt werden, dass die Stäbchen-Photorezeptoren (Stäbchen-PRs) der Retina adulter Wildtyp (WT)-Mäuse, bei denen das Heterochromatin (HC) in einem einzigen zentral gelegenen Chromocenter angeordnet ist, einen Reparaturdefekt von durch Röntgenstrahlung erzeugten DSBs aufweisen, der sich über mehrere Tage beobachten lässt. Dieser bislang unbekannte Reparaturdefekt konnte weder in anderen Zelltypen der adulten Retina noch in Zellen der Niere, des Gehirns oder in den noch nicht ausdifferenzierten Vorläuferzellen der Stäbchen-PRs postnataler WT-Mäuse (P4) beobachtet werden, bei denen eine konventionelle Chromatinorganisation vorliegt. Interessanterweise weisen weder die Stäbchen-PRs noch die Zapfen-PRs oder die Bipolarzellen der Retina adulter WT-Mäuse eine effiziente Akkumulation von 53BP1 und pATM an strahleninduzierte DSBs auf, obwohl ausschließlich in den Stäbchen-PRs ein Reparaturdefekt von DSBs nach Bestrahlung gezeigt werden konnte. Die Beobachtung, dass in DNA-PK-defizienten SCID-Mäusen eine strahleninduzierte Phosphorylierung von H2AX trotz ausbleibender Akkumulation von pATM stattfindet, deutet darauf hin, dass pATM in diesen Zelltypen dennoch vorhanden ist, da die H2AX-Phosphorylierung in diesen Zellen ausschließlich von ATM und DNA-PK durchgeführt wird. In Studien mit ATM-defizienten AT-Mäusen konnte gezeigt werden, dass der Level an verbleibenden DSBs in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse vergleichbar ist mit dem von AT-Mäusen. Die ATM-Defizienz führt zu einer ausbleibenden Phosphorylierung des Heterochromatin-bildenden Faktors KAP1 und einer damit verbundenen fehlenden Relaxation des Chromatins nach Bestrahlung. Dadurch kommt es zu einem Defekt in der Reparatur heterochromatischer DSBs. Auch in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse konnte im Rahmen dieser Arbeit eine fehlende Phosphorylierung von KAP1 nach Bestrahlung nachgewiesen werden. In den Zapfen-PRs und den Bipolarzellen der Retina adulter WT-Mäuse, in denen ebenfalls keine effiziente Akkumulation von pATM und 53BP1 an den DSBs zu beobachten war, konnte dagegen eine Phosphorylierung von KAP1 gezeigt werden. Der Reparaturdefekt in Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse korreliert also sowohl mit der einzigartigen Chromatinstruktur als auch mit der fehlenden strahleninduzierten Phosphorylierung von KAP1 in diesem Zelltyp. Da bereits in vorangegangenen Arbeiten gezeigt werden konnte, dass sich DSBs innerhalb des Chromatins bewegen können, wurde im weiteren Verlauf dieser Arbeit der Transport strahleninduzierter DSBs nach Bestrahlung mit Schwerionen in Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse untersucht. Diese Experimente zeigten, dass auch in diesem Zelltyp bereits kurz nach Bestrahlung ein Transport strahleninduzierter DSBs stattfindet. Des Weiteren wurde die Lokalisation strahleninduzierter H2AX-Foci innerhalb des Chromatins der Stäbchen-PRs während der Reparatur nach Röntgenstrahlung analysiert. Dabei wurde ebenfalls die Beteiligung der Kinasen ATM und DNA-PK bei der Phosphorylierung von H2AX innerhalb verschiedener Chromatin-Bereiche untersucht. Zusätzlich zu den in vivo-bestrahlten WT-, AT- und SCID-Mäusen wurden dafür ex vivo-kultivierte Retina-Explantate verwendet, welche mit Inhibitoren für ATM und DNA-PK behandelt wurden. Hierbei konnte gezeigt werden, dass H2AX in den ersten Minuten nach Bestrahlung überwiegend im Euchromatin (EC) aber zum Teil auch im fakultativen HC phosphoryliert wird. Erst mehrere Minuten nach Bestrahlung konnte auch im konstitiutiven HC eine Phosphorylierung von H2AX beobachtet werden. Es stellte sich heraus, dass die innerhalb der ersten Minuten überwiegend im EC auftretende Phosphorylierung von H2AX ATM-abhängig ist. Im weiteren Verlauf können sowohl ATM als auch DNA-PK die Phosphorylierung von H2AX durchführen. Dabei liefert diese Arbeit erstmals Hinweise darauf, dass die DNA-PK für die Phosphorylierung von H2AX im konstitutiven HC verantwortlich zu sein scheint. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Retina der Maus in dieser Arbeit als ein neues in vivo-Modell für die Reparatur strahleninduzierter DSBs etabliert wurde. Da die Retina ein im Gegensatz zum restlichen Gehirn einfach aufgebautes und schnell zugängliches Gewebemodell darstellt, kann diese in Zukunft zum besseren Verständnis für die Zelltyp-spezifischen Vorgänge nach Einwirkung ionisierender Strahlung im zentralen Nervensystem beitragen. Mit den Stäbchen-PRs als dominierendem Zelltyp bietet die Retina von Mäusen außerdem ein gutes Modellsystem für die Analyse der DSB-Reparatur im HC, sowie für die Untersuchung der Transportmechanismen von DSBs in verschiedenen Chromatin-Bereichen. Durch die Beobachtung, dass in den Stäbchen-PRs adulter WT-Mäuse ein Defekt in der Reparatur strahleninduzierter DSBs auftritt, konnte erstmals nachgewiesen werden, dass die Chromatinorganisation auch bei Säugern in vivo eine entscheidende Rolle bei der DSB-Reparatur spielt

Inefficient Double-Strand Break Repair in Murine Rod Photoreceptors with Inverted Heterochromatin Organization.

BACKGROUND DNA double-strand break (DSB) repair is crucial for the maintenance of genomic stability, and chromatin organization represents one important factor influencing repair efficiency. Mouse rod photoreceptors with their inverted heterochromatin organization containing a single large chromocenter in the middle of the nucleus provide a unique model system to study DSB repair in heterochromatin of living animals. RESULTS We observed that adult rod photoreceptors repair only half of the induced DSBs within 1 day after damage induction, a defect that is neither observed in any other cell type of the adult retina nor in rod photoreceptor precursor cells of postnatal day 4 mice. We show that adult wild-type rods are deficient in a repair pathway involving ATM, a protein that promotes heterochromatic DSB repair by phosphorylating KAP1 and facilitating heterochromatin relaxation. Of note, we observed that rods fail to robustly accumulate active ATM at DSBs, exhibit low KAP1 levels, and display high levels of SPOC1, a factor suppressing KAP1 phosphorylation. Collectively, this results in dramatically reduced KAP1 phosphorylation and the inability to repair heterochromatic DSBs. CONCLUSIONS Because the distinct heterochromatic structure of rods focuses transmitting light to enable vision at low photon levels, the inability to phosphorylate KAP1 and the failure to relax heterochromatin could serve to maintain this structure and the functionality of rods in the presence of DSBs. Collectively, our findings show that the unique chromatin organization of adult rods renders them incapable to efficiently repair heterochromatic DSBs, providing evidence that heterochromatin affects mammalian DSB repair in vivo

Inefficient Double-Strand Break Repair in Murine Rod Photoreceptors with Inverted Heterochromatin Organization.

BACKGROUND DNA double-strand break (DSB) repair is crucial for the maintenance of genomic stability, and chromatin organization represents one important factor influencing repair efficiency. Mouse rod photoreceptors with their inverted heterochromatin organization containing a single large chromocenter in the middle of the nucleus provide a unique model system to study DSB repair in heterochromatin of living animals. RESULTS We observed that adult rod photoreceptors repair only half of the induced DSBs within 1 day after damage induction, a defect that is neither observed in any other cell type of the adult retina nor in rod photoreceptor precursor cells of postnatal day 4 mice. We show that adult wild-type rods are deficient in a repair pathway involving ATM, a protein that promotes heterochromatic DSB repair by phosphorylating KAP1 and facilitating heterochromatin relaxation. Of note, we observed that rods fail to robustly accumulate active ATM at DSBs, exhibit low KAP1 levels, and display high levels of SPOC1, a factor suppressing KAP1 phosphorylation. Collectively, this results in dramatically reduced KAP1 phosphorylation and the inability to repair heterochromatic DSBs. CONCLUSIONS Because the distinct heterochromatic structure of rods focuses transmitting light to enable vision at low photon levels, the inability to phosphorylate KAP1 and the failure to relax heterochromatin could serve to maintain this structure and the functionality of rods in the presence of DSBs. Collectively, our findings show that the unique chromatin organization of adult rods renders them incapable to efficiently repair heterochromatic DSBs, providing evidence that heterochromatin affects mammalian DSB repair in vivo

Differences in the Response to DNA Double-Strand Breaks between Rod Photoreceptors of Rodents, Pigs, and Humans.

Genome editing (GE) represents a powerful approach to fight inherited blinding diseases in which the underlying mutations cause the degeneration of the light sensing photoreceptor cells of the retina. Successful GE requires the efficient repair of DNA double-stranded breaks (DSBs) generated during the treatment. Rod photoreceptors of adult mice have a highly specialized chromatin organization, do not efficiently express a variety of DSB response genes and repair DSBs very inefficiently. The DSB repair efficiency in rods of other species including humans is unknown. Here, we used ionizing radiation to analyze the DSB response in rods of various nocturnal and diurnal species, including genetically modified mice, pigs, and humans. We show that the inefficient repair of DSBs in adult mouse rods does not result from their specialized chromatin organization. Instead, the DSB repair efficiency in rods correlates with the level of Kruppel-associated protein-1 (KAP1) expression and its ataxia-telangiectasia mutated (ATM)-dependent phosphorylation. Strikingly, we detected robust KAP1 expression and phosphorylation only in human rods but not in rods of other diurnal species including pigs. Hence, our study provides important information about the uniqueness of the DSB response in human rods which needs to be considered when choosing model systems for the development of GE strategies

Differences in the Response to DNA Double-Strand Breaks between Rod Photoreceptors of Rodents, Pigs, and Humans

Genome editing (GE) represents a powerful approach to fight inherited blinding diseases in which the underlying mutations cause the degeneration of the light sensing photoreceptor cells of the retina. Successful GE requires the efficient repair of DNA double-stranded breaks (DSBs) generated during the treatment. Rod photoreceptors of adult mice have a highly specialized chromatin organization, do not efficiently express a variety of DSB response genes and repair DSBs very inefficiently. The DSB repair efficiency in rods of other species including humans is unknown. Here, we used ionizing radiation to analyze the DSB response in rods of various nocturnal and diurnal species, including genetically modified mice, pigs, and humans. We show that the inefficient repair of DSBs in adult mouse rods does not result from their specialized chromatin organization. Instead, the DSB repair efficiency in rods correlates with the level of Kruppel-associated protein-1 (KAP1) expression and its ataxia-telangiectasia mutated (ATM)-dependent phosphorylation. Strikingly, we detected robust KAP1 expression and phosphorylation only in human rods but not in rods of other diurnal species including pigs. Hence, our study provides important information about the uniqueness of the DSB response in human rods which needs to be considered when choosing model systems for the development of GE strategies