Der frühe Teil der mitochondrialen Eisen-Schwefel-Cluster-Assemblierungsmaschinerie : strukturelle und mechanistische Einblicke

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster sind die ältesten anorganischen Protein-Kofaktoren und ubiquitär in allen Reichen des Lebens vorhanden. Fe/S-Proteine koordinieren häufig essentielle Aufgaben in der Zelle wie z.B. Teile der Zellatmung, der DNA Synthese und der Proteintranslation. Trotz der vergleichsweise einfachen chemischen Struktur und Zusammensetzung von Fe/S-Clustern benötigt die Zelle ein komplexes System für deren Synthese und Einbau in apo-Proteine. Defekte in der Fe/S-Proteinbiogenese sind mit schwerwiegenden Krankheiten, wie z.B. der Friedreich-Ataxie oder der sideroblastischen Anämie verknüpft. Ein besseres Verständnis der Biogenese von Fe/S-Proteinen eröffnet neben dem grundlegenden Verständnis dieses lebenswichtigen Prozesses auch eine eventuelle Behandlung solcher oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. In Eukaryoten beginnt die Synthese von Fe/S-Clustern in den Mitochondrien, bzw. in den verwandten Mitosomen. Diese Organellen beherbergen die sog. „iron-sulfur cluster“ (ISC) Assemblierungsmaschinerie. Der frühe Teil der ISC-Maschinerie dient zur Synthese eines [2Fe-2S]-Clusters auf dem Gerüstprotein Isu1, wozu fünf weitere ISC Komponenten benötigt werden. Der Desulfurasekomplex aus Nfs1 und Isd11 liefert dabei den Schwefel, während das Frataxin Yfh1 als Eisendonor und/oder Schwefelüberträger wirkt. Eisen und Schwefel werden schließlich auf Isu1 unter Elektronenzufuhr durch das Ferredoxin Yah1 und seiner Reduktase Arh1 zu einem Fe/S-Cluster zusammengesetzt. In dieser Arbeit konnten mechanistische und strukturelle Einblicke in die Funktion dieser frühen ISC Maschinerie auf molekularer Ebene gewonnen werden. Erstens konnte auf Basis der durch NMR Spektroskopie atomar aufgelösten Strukturen des Ferredoxins Yah1, des Gerüstproteins Isu1 und des Yah1-Isu1 Komplexes gezeigt werden, wie die beiden Proteine interagieren. Daraus konnte ein Vorschlag abgeleitet werden, wie die Elektronenübertragung vom reduzierten Fe/S-Cluster des Ferredoxins zum Isu1 bewerkstelligt wird. Hierbei spielen vor allem strukturelle Veränderungen innerhalb des Yah1 bei der Reduktion eine große Rolle, wobei das essentielle Histidin 51 als „Elektronenbrücke“ fungieren könnte. Zweitens konnten biochemische Untersuchungen der Interaktionen aller frühen ISC-Faktoren mittels Thermophorese zu einem zeitlich aufgelösten Modell des Mechanismus der initialen Fe/S-Cluster Biogenese beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass alle primären ISC-Faktoren miteinander interagieren und den biosynthetischen Komplex bilden. Dieser ist vom Redoxzustand der Komponenten und der Anwesenheit von Fe(II) und Cystein abhängig. Schließlich konnte auf Basis von SAXS-Daten (SAXS: small angle X-ray scattering) die Gesamtstruktur der frühen ISC-Maschinerie ermittelt werden. Dadurch konnte der frühe ISC-Komplex als Dodekamer mit folgender Stöchiometrie definiert werden: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). Diese strukturellen Daten erlaubten trotz der relativ niedrigen Auflösung erstmals weitreichende Rückschlüsse auf den molekularen 9 Mechanismus der Fe/S-Cluster Biogenese. Der Komplex aus Yah1 und Isu1 ist in räumlicher Nähe zum essentiellen Persulfid-tragenden Cysteinrest des Nfs1 lokalisiert, und ermöglicht damit räumlich eine Persulfidübertragung von Nfs1 auf Isu1. Anschließend kann das Persulfid durch Yah1 reduziert werden. Die bereits vorgeschlagene Funktion des Frataxins Yfh1 als Eisendonor konnte aufgrund seiner Lage im ISC-Komplex und im Speziellen der Position seines konservierten Histidins 23 weiter untermauert werden. Auch die Lage von Isd11 auf Nfs1 konnte erstmals gezeigt werden. Isd11 bindet weit vom aktiven Zentrum des Komplexes entfernt, befindet sich aber in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrum des Nfs1 und der Cysteinbindestelle. Dies lässt den Schluss zu, dass Isd11 die Aktivität von Nfs1 reguliert. Somit konnte auf molekularer Ebene ein Vorschlag für die Herkunft und die Übertragung sowohl des Schwefels als auch des Eisens gemacht und Einblicke in die Lokalisation von Isd11 auf Nfs1 gewonnen werden. Zusammen genommen bilden diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in Richtung des molekularen Verständnisses der Fe/S-Cluster Biogenese und damit auch die Basis für weitere Untersuchungen

Structural Basis for Regulation of the Opposing (p)ppGpp Synthetase and Hydrolase within the Stringent Response Orchestrator Rel

The stringent response enables metabolic adaptation of bacteria under stress conditions and is governed by RelA/SpoT Homolog (RSH)-type enzymes. Long RSH-type enzymes encompass an N-terminal domain (NTD) harboring the second messenger nucleotide (p)ppGpp hydrolase and synthetase activity and a stress-perceiving and regulatory C-terminal domain (CTD). CTD-mediated binding of Rel to stalled ribosomes boosts (p)ppGpp synthesis. However, how the opposing activities of the NTD are controlled in the absence of stress was poorly understood. Here, we demonstrate on the RSH-type protein Rel that the critical regulative elements reside within the TGS (ThrRS, GTPase, and SpoT) subdomain of the CTD, which associates to and represses the synthetase to concomitantly allow for activation of the hydrolase. Furthermore, we show that Rel forms homodimers, which appear to control the interaction with deacylated-tRNA, but not the enzymatic activity of Rel. Collectively, our study provides a detailed molecular view into the mechanism of stringent response repression in the absence of stress

The iron-sulfur cluster assembly (ISC) protein Iba57 executes a tetrahydrofolate-independent function in mitochondrial [4Fe-4S] protein maturation

Mitochondria harbor the bacteria-inherited iron-sulfur cluster assembly (ISC) machinery to generate [2Fe-2S] and [4Fe-4S] proteins. In yeast, assembly of [4Fe-4S] proteins specifically involves the ISC proteins Isa1, Isa2, Iba57, Bol3, and Nfu1. Functional defects in their human equivalents cause the multiple mitochondrial dysfunction syndromes (MMDS), severe disorders with a broad clinical spectrum. The bacterial Iba57 ancestor YgfZ was described to require tetrahydrofolate (THF) for its function in the maturation of selected [4Fe-4S] proteins. Both YgfZ and Iba57 are structurally related to an enzyme family catalyzing THF-dependent one-carbon transfer reactions including GcvT of the glycine cleavage system. On this basis, a universally conserved folate requirement in ISC-dependent [4Fe-4S] protein biogenesis was proposed. To test this idea for mitochondrial Iba57, we performed genetic and biochemical studies in S. cerevisiae, and we solved the crystal structure of Iba57 from the thermophilic fungus Chaetomium thermophilum. We provide three lines of evidence for the THF independence of the Iba57-catalyzed [4Fe-4S] protein assembly pathway. First, yeast mutants lacking folate show no defect in mitochondrial [4Fe-4S] protein maturation. Second, the 3D structure of Iba57 lacks many of the side chain contacts to THF as defined in GcvT, and the THF binding pocket is constricted. Third, mutations in conserved Iba57 residues that are essential for THF-dependent catalysis in GcvT do not impair Iba57 function in vivo, in contrast to an exchange of the invariant, surface-exposed cysteine residue. We conclude that mitochondrial Iba57, despite structural similarities to both YgfZ and THF-binding proteins, does not utilize folate for its function

Der frühe Teil der mitochondrialen Eisen-Schwefel-Cluster-Assemblierungsmaschinerie : strukturelle und mechanistische Einblicke

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster sind die ältesten anorganischen Protein-Kofaktoren und ubiquitär in allen Reichen des Lebens vorhanden. Fe/S-Proteine koordinieren häufig essentielle Aufgaben in der Zelle wie z.B. Teile der Zellatmung, der DNA Synthese und der Proteintranslation. Trotz der vergleichsweise einfachen chemischen Struktur und Zusammensetzung von Fe/S-Clustern benötigt die Zelle ein komplexes System für deren Synthese und Einbau in apo-Proteine. Defekte in der Fe/S-Proteinbiogenese sind mit schwerwiegenden Krankheiten, wie z.B. der Friedreich-Ataxie oder der sideroblastischen Anämie verknüpft. Ein besseres Verständnis der Biogenese von Fe/S-Proteinen eröffnet neben dem grundlegenden Verständnis dieses lebenswichtigen Prozesses auch eine eventuelle Behandlung solcher oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. In Eukaryoten beginnt die Synthese von Fe/S-Clustern in den Mitochondrien, bzw. in den verwandten Mitosomen. Diese Organellen beherbergen die sog. „iron-sulfur cluster“ (ISC) Assemblierungsmaschinerie. Der frühe Teil der ISC-Maschinerie dient zur Synthese eines [2Fe-2S]-Clusters auf dem Gerüstprotein Isu1, wozu fünf weitere ISC Komponenten benötigt werden. Der Desulfurasekomplex aus Nfs1 und Isd11 liefert dabei den Schwefel, während das Frataxin Yfh1 als Eisendonor und/oder Schwefelüberträger wirkt. Eisen und Schwefel werden schließlich auf Isu1 unter Elektronenzufuhr durch das Ferredoxin Yah1 und seiner Reduktase Arh1 zu einem Fe/S-Cluster zusammengesetzt. In dieser Arbeit konnten mechanistische und strukturelle Einblicke in die Funktion dieser frühen ISC Maschinerie auf molekularer Ebene gewonnen werden. Erstens konnte auf Basis der durch NMR Spektroskopie atomar aufgelösten Strukturen des Ferredoxins Yah1, des Gerüstproteins Isu1 und des Yah1-Isu1 Komplexes gezeigt werden, wie die beiden Proteine interagieren. Daraus konnte ein Vorschlag abgeleitet werden, wie die Elektronenübertragung vom reduzierten Fe/S-Cluster des Ferredoxins zum Isu1 bewerkstelligt wird. Hierbei spielen vor allem strukturelle Veränderungen innerhalb des Yah1 bei der Reduktion eine große Rolle, wobei das essentielle Histidin 51 als „Elektronenbrücke“ fungieren könnte. Zweitens konnten biochemische Untersuchungen der Interaktionen aller frühen ISC-Faktoren mittels Thermophorese zu einem zeitlich aufgelösten Modell des Mechanismus der initialen Fe/S-Cluster Biogenese beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass alle primären ISC-Faktoren miteinander interagieren und den biosynthetischen Komplex bilden. Dieser ist vom Redoxzustand der Komponenten und der Anwesenheit von Fe(II) und Cystein abhängig. Schließlich konnte auf Basis von SAXS-Daten (SAXS: small angle X-ray scattering) die Gesamtstruktur der frühen ISC-Maschinerie ermittelt werden. Dadurch konnte der frühe ISC-Komplex als Dodekamer mit folgender Stöchiometrie definiert werden: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). Diese strukturellen Daten erlaubten trotz der relativ niedrigen Auflösung erstmals weitreichende Rückschlüsse auf den molekularen 9 Mechanismus der Fe/S-Cluster Biogenese. Der Komplex aus Yah1 und Isu1 ist in räumlicher Nähe zum essentiellen Persulfid-tragenden Cysteinrest des Nfs1 lokalisiert, und ermöglicht damit räumlich eine Persulfidübertragung von Nfs1 auf Isu1. Anschließend kann das Persulfid durch Yah1 reduziert werden. Die bereits vorgeschlagene Funktion des Frataxins Yfh1 als Eisendonor konnte aufgrund seiner Lage im ISC-Komplex und im Speziellen der Position seines konservierten Histidins 23 weiter untermauert werden. Auch die Lage von Isd11 auf Nfs1 konnte erstmals gezeigt werden. Isd11 bindet weit vom aktiven Zentrum des Komplexes entfernt, befindet sich aber in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrum des Nfs1 und der Cysteinbindestelle. Dies lässt den Schluss zu, dass Isd11 die Aktivität von Nfs1 reguliert. Somit konnte auf molekularer Ebene ein Vorschlag für die Herkunft und die Übertragung sowohl des Schwefels als auch des Eisens gemacht und Einblicke in die Lokalisation von Isd11 auf Nfs1 gewonnen werden. Zusammen genommen bilden diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in Richtung des molekularen Verständnisses der Fe/S-Cluster Biogenese und damit auch die Basis für weitere Untersuchungen