Molekularna i fenotypowa charakterystyka szczepów Staphylococcus aureus wyizolowanych od krów z zapaleniem gruczołu mlekowego

Wydział PrzyrodniczyPrzedmiotem badań były 123 szczepy S. aureus wyizolowane w latach 2007-2008 z mleka pochodzącego od krów ze stad hodowlanych w Polsce północno-wschodniej, u których stwierdzono podkliniczne zapalenie gruczołu mlekowego. Celem pracy była ocena występowania u tych szczepów wybranych czynników zjadliwości, ważnych w patogenezie mastitis takich, jak wytwarzanie enzymów proteolitycznych, lipolitycznych, hialuronidazy oraz zdolność tworzenia biofilmu. Oceniono także występowanie w genomach badanych szczepów S. aureus genów kodujących adhezyny, proteazy, toksyny oraz genów związanych z tworzeniem biofilmu. Ponadto szczepy S. aureus zostały przeanalizowane pod względem wrażliwości na wybrane antybiotyki i inne substancje o aktywności przeciwdrobnoustrojowej oraz pod względem zróżnicowania genetycznego. Przynależność do gatunku S. aureus potwierdzona została w oparciu o morfologię komórek, zdolność wytwarzania katalazy, sposób wzrostu izolatów na agarze odżywczym z dodatkiem 5% krwi baraniej i na podłożu Chapmana oraz na podstawie pozytywnego testu na obecność czynnika CF. Ostatecznie przynależność izolatów do gatunku S. aureus potwierdzono wykonując reakcję amplifikacji fragmentu genu nuc, kodującego termostabilną nukleazę, w której użyto starterów specyficznych dla zakonserwowanego fragmentu genu nuc, występującego u S. aureus. Zdolność tworzenia biofilmu przez szczepy S. aureus na powierzchni polistyrenowej oceniono stosując płytki titracyjne. Badanie wrażliwości szczepów na antybiotyki przeprowadzano metodą dyfuzyjno-krążkową, natomiast wytwarzanie β-laktamaz oceniano wykorzystując pałeczki z nitrocefiną. Obecność genów kodujących wybrane czynniki wirulencji (geny kodujące proteazy, adhezyny, toksyny, białka uczestniczące w tworzeniu biofilmu) oraz geny kodujące mechanizmy oporności S. aureus na antybiotyki β-laktamowe, wykrywano stosując technikę PCR. Dokonano również oceny aktywności przeciwdrobnoustrojowej lizostafiny, nizyny oraz polimyksyny B ustalając wartości MIC dla szczepów S. aureus, wykazujących oporność na co najmniej jeden badany antybiotyk. Typowanie molekularne szczepów S. aureus zostało przeprowadzone w oparciu o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu coa (PCR/RFLP). Wszystkie oceniane szczepy S. aureus wytwarzały proteazy oraz powodowały hemolizę typu β. Większość szczepów wytwarzała fosfolipazy, natomiast ponad połowa szczepów S. aureus wytwarzała hialuronidazę. W grupie 123 szczepów S. aureus 61,8% tworzyło biofilm na powierzchni polistyrenowej. Stwierdzono, że nie wszystkie szczepy, u których wykryto geny operonu ica, kodujące białka związane z tworzeniem biofilmu, wytwarzały biofilm na powierzchni polistyrenowej. Wśród genów kodujących białka umożliwiające przyleganie S. aureus do macierzy zewnątrzkomórkowej, najczęściej identyfikowano gen eno (91,9%), kodujący białko wiążące lamininę oraz gen fib (82,9%), kodujący białko wiążące fibrynogen. Geny fnbA i fnbB kodujące adhezyny wiążące fibronektynę były obecne u 64,5% szczepów. Analiza klasterowa genów kodujących adhezyny wykazała, że geny fib, eno i fnbB należały do grupy genów często identyfikowanych w ocenianej populacji szczepów S. aureus, w odróżnieniu od genów cna, bbp, fnbA i ebps, które należały do grupy genów rzadko identyfikowanych. Na podstawie obecności w genomach ocenianych szczepów S. aureus genów kodujących białka adhezyjne zidentyfikowano 17 różnych genotypów. Najczęściej identyfikowaną grupą genów kodujących proteazy były geny kodujące proteazy serynowe, natomiast geny kodujące toksyny eksfoliatywne występowały rzadko u ocenianych szczepów S. aureus. Występowanie genów kodujących proteazy serynowe było podstawą do wyróżnienia 12 genotypów, z których 3 były najczęstsze. Geny kodujące enterotoksyny zidentyfikowano u 35,8% szczepów S. aureus. Geny sei (21,1%), sem (19,5%), sen (19,5%), seg (18,7%) i seo (13,8%) występowały częściej niż inne geny kodujące enterotoksyny i tworzyły jeden klaster genów. W oparciu o wyniki identyfikacji wybranych genów utworzono wirulotypy, które wystąpiły w badanej populacji szczepów S. aureus. Około 18% szczepów należało do wirulotypu zawierającego geny kodujące proteazy serynowe, tj. splA, splE i sspA oraz geny fib, eno i fnbB, kodujące adhezyny. W grupie ocenianych szczepów największą oporność zaobserwowano w przypadku antybiotyków β-laktamowych z grupy penicylin. Większość szczepów wykazujących oporność na tę grupę antybiotyków miało gen blaZ. Dwa szczepy S. aureus były wielooporne, z których jeden wykazywał oporność na antybiotyki należące do aminoglikozydów, linkozamidów oraz makrolidów, natomiast drugi był dodatkowo oporny na penicylinę. Szczepy S. aureus były wrażliwe na działanie lizostafiny, gdyż uzyskane wartości MIC w stosunku do badanych szczepów mieściły się w zakresie 0,008-0,5 μg/ml. Ponad połowa szczepów S. aureus była wrażliwa na nizynę, a uzyskane wartości MIC zawierały się w zakresie 12,8-25,6 μg/ml. W oparciu o analizę polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych amplifikowanego fragmentu genu coa (PCR/RFLP) wśród szczepów S. aureus pochodzących od krów z objawami mastitis ze stad hodowlanych w Polsce północno-wschodniej wyodrębniono 11 różnych genotypów. Większość szczepów (ponad 67%) należała do jednego genotypu.The subject of the study were 123 S. aureus strains, isolated in 2007-2008, from cow milk. Animals came from breeding herds in north-eastern Poland, they were found to have subclinical mastitis. The aim of this study was to evaluate the prevalence in S. aureus strains selected virulence factors that are important in the pathogenesis of mastitis, such as the production of proteolytic and lipolytic enzymes, hyaluronidase and the ability to form biofilms. S. aureus strains were also evaluated to occur in their genomes genes coding for adhesins, proteases, toxins and genes associated with biofilm formation. In addition, S. aureus strains were analyzed for susceptibility to selected antibiotics and other substances having antimicrobial activity and in terms of genetic diversity. Belonging to the S. aureus species was confirmed on the basis of cell morphology, the ability to produce catalase, the type of growth on nutrient agar with 5% sheep blood and Chapman medium and on the basis of a positive test for the presence of the CF factor. Finally, belonging to the S. aureus species was confirmed by performing an amplification reaction of the fragment of nuc gene, encoding a thermostable nuclease. Primers used in the reaction were specific for conserved nuc gene fragment present in S. aureus. The ability to form biofilm by S. aureus on the polystyrene surface was evaluated using microtiter plates. The study of S. aureus susceptibility to antibiotics was performed by disc diffusion test, while the production of β-lactamases was evaluated using sticks with nitrocefin. The presence of genes encoding selected virulence factors (the genes encoding proteases, adhesins, toxins, proteins involved in biofilm formation) and genes encoding resistance mechanisms of S. aureus to β-lactam antibiotics, were detected by PCR method. It was also assessed the antimicrobial activity of lysostaphin, nisin and a polymyxin B in determining the MIC values for S. aureus strains, which were resistant to at least one of the tested antibiotics. Molecular typing of S. aureus strains was performed by doing the analysis of polymorphisms restriction fragments length of amplified coa gene fragment (PCR/RFLP). All evaluated strains of S. aureus produced proteases and caused type β hemolysis. Most of the strains produced phospholipases, and over half of the S. aureus strains produced hyaluronidase. Among 123 strains of S. aureus, 61,8 % formed biofilm on the polystyrene surface. It has been found that not all the strains carrying genes of the ica operon encoding proteins involved in the biofilm formation, produced biofilm on the polystyrene surface. Among the genes encoding proteins that enables S. aureus to adhere to the extracellular matrix, usually identified genes were eno (91,9%), encoding the laminin binding protein and the fib gene (82,9%), encoding a fibrinogen binding protein. Genes fnbA and fnbB coding fibronectin binding adhesin were present in 64,5% strains. Cluster analysis of the genes encoding the adhesins showed, that genes fib, eno and fnbB belonged to the group of genes which were often identified in the evaluated population of S. aureus strains, as compared with the genes cna, bbp, fnbA and ebps that belonged to the group of genes identified infrequently. On the basis of the presence in the genomes of evaluated S. aureus strains genes encoding adhesin proteins, it was identified 17 different genotypes. The most frequently identified group of genes encoding proteases were genes encoding serine proteases, while genes encoding exfoliative toxins were rarely identified in evaluated S. aureus strains. The presence of genes encoding serine proteases was the basis to distinguish 12 genotypes, of which 3 were the most common. The genes encoding enterotoxins have been identified in 35,8% of S. aureus strains. Genes sei (21,1%), sem (19,5%), sen (19,5%) , seg (18,7%) and seo (13,8%) occurred more frequently than other genes encoding enterotoxin and formed one gene cluster. Based on the results of the identification of selected genes, it was created virulotypes, that occurred in the evaluated population of S. aureus strains. About 18% of strains belonged to virulotype containing genes encoding serine proteases: splA, splE and sspA and genes fib, eno and fnbB encoding adhesins. It was observed that among evaluated strains, the most of them were resistant to β-lactam antibiotics from the group of penicillins. Most strains exhibiting resistance to this group of antibiotics carried gene blaZ. Two S. aureus strains were multidrug - resistant, one of which was resistant to the antibiotics belonging to the aminoglycosides, lincosamides and macrolides, and the other was also resistant to penicillin. S. aureus strains were sensitive to lysostaphin, since the resultant value of MIC against the tested strains ranged 0,008-0,5 μg/ml. Over half of S. aureus strains were sensitive to nisin and the obtained MIC values were within the range 12,8-25,6 μg /ml. Based on the analysis of polymorphisms restriction fragments length of amplified coa gene fragment (PCR/RFLP) among S. aureus strains derived from cows with symptoms of mastitis from breeding herds in north-eastern Poland, it was distinguished 11 different genotypes. Most strains (over 67%) belonged to one genotype

Biofilm Formation by Methicillin-Resistant and Methicillin-Sensitive Staphylococcus aureus Strains from Hospitalized Patients in Poland

Biofilm-mediated infections in the hospital environment have a significant negative impact on patient health. This study aimed to investigate biofilm production in vitro and the presence of icaABCD genes in methicillin-resistant S. aureus (MRSA) and methicillin-sensitive S. aureus (MSSA) strains isolated from hospitalized patients. MRSA (73) and MSSA (57) strains were evaluated for biofilm production by the microtiter plate method. The presence of ica operon was investigated by PCR. Out of 130 strains, 99.2% were biofilm producers. Strong biofilms were formed by 39.7% of MRSA and 36.8% of MSSA strains. The highest percentage of strong biofilm producers was found among the strains isolated from sputum and tracheostomy tube (66.7%), nose and catheter (50%), throat (44.4%), and bronchoalveolar washings (43.8%). The strains isolated from bronchoalveolar washings produced significantly more biofilm than strains isolated from wound and anus. The ability of biofilm forming by fecal strains was significantly lower compared to strains from other materials. MRSA strains had significantly higher ability of biofilm formation than MSSA strains (P = 0.000247). The presence of ica operon in MRSA was detected in all strains. Comparison of strong biofilm biomass of the strains with icaABCD, icaABD, and icaAD revealed that strains with icaABCD and icaABD produced highly significantly more biofilm than strains with icaAD. Biofilm forming by both MRSA and MSSA strains indicates high ability of theses strains to persist in hospital environment which increases the risk of disease development in hospitalized patients