Improvement of in vivo anticancer and antiangiogenic potential of thalidomide derivatives

AbstractThe strategy of antiangiogenic drugs is based on inhibiting formation of new blood vessels as alternative to limit cancer progression. In this work, we investigated the antitumor and antiangiogenic potential of eight thalidomide derivatives. Most of the molecules was not cytotoxic but 2a, 2d and 3d revealed weak antiproliferative activity on HL-60, Sarcoma 180 (S180) and normal peripheral blood mononuclear cells. Thalidomide, 2a and 2b were able to inhibit tumor growth (53.5%, 67.9% and 67.4%, respectively) in S180-bearing mice and presented moderate and reversible toxicity on liver, kidneys and spleens. Both analogs (2a and 2b) inhibited cell migration of endothelial (HUVEC) and melanoma cells (MDA/MB-435) at 50μg/mL. Immunohistochemistry labeling assays with CD-31 (PECAM-1) antibody showed microvascular density (MVD) was significantly reduced in thalidomide, 2a and 2b groups (30±4.9, 64.6±1.8 and 46.5±19.5%, respectively) (p<0.05). Neovascularization evaluated by Chorioallantoic Membrane Assay (CAM) with compounds 2a and 2b showed reduction of vessels’ number (12. 9±2.3 and 14.8±3.3%), neovascularization area (13.1±1.7 and 14.3±1.7%) and total length of vessels (9.2±1.5 and 9.9±1.9%). On the other hand, thalidomide did not alter vascularization parameters. Consequently, addition of thiosemicarbazone pharmacophore group into the phthalimidic ring improved the in vivo antitumor and antiangiogenic potential of the analogs 2a and 2b

In vivo quantification of corneal angiogenesis using digital image processing

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel SuperiorUm programa de computador foi desenvolvido especificamente para a segmentaÃÃo e quantificaÃÃo de angiogÃnese corneana em imagens digitais capturadas in vivo. O propÃsito foi estabelecer um mÃtodo automÃtico para quantificar, de forma rÃpida, objetiva e acurada, a progressÃo temporal da resposta angiogÃnica. Desenvolveu-se ainda um modelo de angiogÃnese corneana inflamatÃria em coelhos, induzida por uma cauterizaÃÃo alcalina pontual, onde a resposta angiogÃnica foi avaliada, conforme cinco mÃtodos manuais, nos dias 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21 apÃs a cauterizaÃÃo, ocasiÃes em que tambÃm foram obtidas, de maneira padronizada, imagens digitais da cÃrnea. O software à composto de cinco mÃdulos, com funÃÃes especÃficas, que identificam e segmentam automaticamente os neovasos e quantificam a resposta angiogÃnica mediante a determinaÃÃo de trÃs parÃmetros principais: Ãrea de neovascularizaÃÃo, comprimento vascular total e nÃmero de vasos sangÃÃneos. Assim, o sistema dispensa a rotulaÃÃo prÃvia da neovascularizaÃÃo, propiciando, por conseguinte, o monitoramento espacial e temporal da resposta angiogÃnica in vivo. A avaliaÃÃo da validade do mÃtodo automÃtico proposto envolveu a determinaÃÃo do grau da correlaÃÃo entre cada um dos quantificadores automÃticos e os cinco parÃmetros manuais. Compreendeu ainda a comparaÃÃo do reconhecimento automÃtico dos vasos sangÃÃneos realizado pelo software em 50 subimagens com o reconhecimento manual efetuado, consensualmente, por trÃs examinadores (padrÃo-ouro), determinando-se entÃo a sensibilidade, especificidade e o coeficiente de concordÃncia kappa. Para avaliar a confiabilidade, trÃs examinadores utilizaram o mÃtodo automÃtico para analisar 50 imagens em dois momentos. A concordÃncia intra e interexaminadores foi medida pelo coeficiente de correlaÃÃo intraclasse. Para ilustrar a utilidade do mÃtodo automÃtico, delineou-se um ensaio que avaliou o efeito dos fÃrmacos prednisona, talidomida, Ãcido acetilsalicÃlico, etoricoxib e celecoxib no modelo de angiogÃnese corneana inflamatÃria. A anÃlise dos grÃficos dos quantificadores manuais e automÃticos revelou que a evoluÃÃo temporal da resposta angiogÃnica no modelo de angiogÃnese corneana inflamatÃria seguiu um padrÃo bifÃsico: crescimento exponencial atà o dia 12 (fase de proliferaÃÃo), seguido de crescimento linear atà o dia 21 (fase de maturaÃÃo). Constatou-se uma forte correlaÃÃo linear positiva estatisticamente significante entre os quantificadores automÃticos e manuais, denotando que o mÃtodo automÃtico mensurou a resposta angiogÃnica de forma anÃloga à realizada pelo mÃtodo manual. A sensibilidade do mÃtodo automÃtico foi 85,32%, enquanto sua especificidade foi 96,37%. A concordÃncia entre o reconhecimento manual e o reconhecimento automÃtico dos vasos sangÃÃneos foi classificada pela estatÃstica kappa como quase perfeita. A concordÃncia interexaminadores foi avaliada em seis situaÃÃes, sendo classificada como excelente em quatro delas e como boa nas outras duas. A concordÃncia intra-examinador foi mensurada em nove situaÃÃes, sendo classificada como boa em apenas uma e como excelente nas demais. AlÃm disso, o sistema automÃtico foi capaz de identificar diferenÃas na intensidade do efeito antiangiogÃnico dos diferentes fÃrmacos avaliados, possibilitando graduar a atividade inibitÃria em plena (prednisona), parcial (talidomida, Ãcido acetilsalicÃlico e etoricoxib) e insuficiente (celecoxib), demonstrando, assim, o seu valor como mÃtodo para anÃlise quantitativa de angiogÃnese. Portanto, tais dados demonstram que o sistema automÃtico proposto constitui um mÃtodo de quantificaÃÃo de angiogÃnese acurado e reprodutÃvel.A software was developed specifically for segmentation and quantification of corneal angiogenesis in digital images acquired in vivo. The purpose was to establish an automatic method to quantify the corneal progression of the neovascular response in a rapid, objective and accurate manner. It was also developed a model of inflammatory corneal angiogenesis in rabbits induced by a punctual alkaline cauterization. Angiogenic response was evaluated at days 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 after cauterization. At these occasions, digital images of cornea were also captured in a standardized fashion. The software is composed of five modules, each with specific functions, which automatically identify and segment the neovessels and quantify the neovascular response through the calculation of three main parameters: neovascularization area, total vascular length and blood vessels number. Thus, the system does not require previous enhancement of the neovascularization, so that it provides the temporal and spatial monitoring of the angiogenic response in vivo. To assess the validity of the automatic method, it was determined the correlation degree between each automatic parameters and the five manual variables. It was also evaluated by comparing automatic recognition of blood vessels performed by the software on 50 subimages with the manual recognition performed by three raters by consensus (gold-standard) and then calculating the sensitivity, specificity and kappa coefficient. To assess reliability, three raters used the automatic method for analysing 50 images at two moments. The intra and inter-raters agreement was assessed by calculating intraclass correlation coefficient. To illustrate the utility of the automatic method, it was designed an assay that evaluated the effect of prednisone, thalidomide, acetylsalicylic acid, etoricoxib and celecoxib in the model of inflammatory corneal angiogenesis. The analysis of the graphics of the manual and automatic parameters showed that the temporal progression of the neovascular response in this model followed a biphasic pattern: exponential growth until day 12 (proliferation phase), followed by linear growth until day 21 (maturation phase). It was found a statistically significant positive linear correlation between automatic and manual variables, denoting that both methods measured the angiogenic response in an analogous fashion. The sensitivity of the automatic method was 85.32% and the specificity was 96.37%. The agreement between manual and automatic recognition of blood vessels was classified as almost perfect, according to kappa statistics. The inter-raters agreement was measured in six situations and it was classified as good in two of them and as excellent in the others. Among the nine situations analysed, the intra-rater agreement was classified as good in only one of them and as excellent in the others. Furthermore, the automatic system was able to detect differences in the intensity of the antiangiogenic effect of tested drugs, allowing the inhibitory activity to be graduated as full (prednisone), partial (thalidomide, acetylsalicylic acid and etoricoxib) and insufficient (celecoxib), demonstrating, thus, its value as method for quantitative analysis of angiogenesis. Therefore, such results demonstrate that the proposed automatic system constitutes an accurate and reproducible method of angiogenesis quantification

Modelo de angiogênese inflamatória em córnea de coelho induzida pela cauterização alcalina pontual Model of inflammatory angiogenesis in rabbit cornea induced by punctual alkaline cauterization

OBJETIVO: Estabelecer um modelo de angiogênese em córnea de coelho, induzida pela cauterização pontual com hidróxido de sódio. MÉTODOS: Seis coelhos foram submetidos a uma cauterização pontual na córnea direita, utilizando-se uma peça circular (3 mm) de papel filtro, previamente embebida em NaOH 1 M, a qual foi posicionada a 1mm do limbo superior durante 2 minutos. Os animais foram avaliados nos dias 3, 6, 9, 12, 15, 18 e 21, após a cauterização. A quantificação da angiogênese foi realizada de acordo com 4 métodos: comprimento vascular radial (V), índice angiogênico (I), área do triângulo (T) e do setor de coroa circular (S), ambas medidas aproximadas da área de neovascularização. RESULTADOS: A análise das curvas dos quantificadores revelou que a resposta angiogênica seguiu um padrão bifásico: crescente até o 12º dia (proliferação), estável do 12º ao 21º dia (maturação). Comportamento também observado na taxa de crescimento vascular, que foi 16 vezes maior no período de 0 a 12 dias do que no intervalo entre o 12º e o 21º dia. Foi constatada, ainda, uma correlação linear positiva estatisticamente significante entre os 4 quantificadores de angiogênese. CONCLUSÃO: A cauterização alcalina pontual da córnea de coelho induz e mantém neovascularização corneana, podendo, assim, ser utilizada como modelo de angiogênese.<br>PURPOSE: To establish a model of angiogenesis in rabbit cornea induced by punctual alkaline cauterization. METHODS: Six rabbits were submitted to punctual cauterization in right cornea. It was used a circular piece (3 mm) of filter paper, that was previously soaked in 1 M NaOH and placed 1 mm from the superior limbus for 2 minutes. The animals were evaluated at 3, 6, 9, 12, 15, 18 and 21 days after cauterization. Quantification of angiogenesis was performed according to 4 methods: radial vessel length (V), angiogenic index (I), area of the triangle (T) and area of the circular band sector (S), which provide an approximation of the area of neovascularization. RESULTS: The analysis of the quantitative data of angiogenesis showed that neovascular response progressed in a biphasic manner: rising between days 0 and 12 (proliferation), stable between days 12 and 21 (maturation). This pattern was observed on the values of the vascular growth mean rate. Between days 0 and 12, it was 16 times greater than that verified between days 12 and 21. It was found a statiscally significant positive linear correlation among the 4 methods of measurement of angiogenesis. CONCLUSION: The punctual alkaline cauterization of the rabbit cornea induces and sustains corneal neovascularization, so that, it can be used as model of angiogenesis

Experimental model of ultrasound thermotherapy in rats inoculated with Walker-236 tumor Modelo experimental de termoterapia ultrassônica em ratos inoculados com tumor de Walker-236

PURPOSE: To develop a model to evaluate the effects of focal pulsed ultrasound (US) waves as a source of heat for treatment of murine subcutaneous implanted Walker tumor. METHODS: An experimental, controlled, comparative study was conducted. Twenty male Wistar rats (160-300 g) randomized in 2 equal groups (G-1: Control and G-2: Hyperthermia) were inoculated with Walker-256 carcinosarcoma tumor. After 5 days G-2 rats were submitted to 45ºC hyperthermia. Heat was delivered directly to the tumor by an ultrasound (US) equipment (3 MHz frequency, 1,5W/cm³). Tumor temperature reached 45º C in 3 minutes and was maintained at this level for 5 minutes. Tumor volume was measured on days 5, 8, 11, 14 e 17 post inoculation in both groups. Unpaired t-test was used for comparison. P<0.05 was considered significant. RESULTS: Tumor volume was significantly greater in day 5 and decreased in days 11, 14 and 17 in treated rats. Rats treated with hyperthermia survived longer than control animals. On the 29th day following tumor inoculation, 40% of control rats and 77.78% of hyperthermia-treated rats remained alive. CONCLUSION: The proposed model is quite simple and may be used in less sophisticated laboratory settings for studying the effects of focal hyperthermia in the treatment of malignant implanted tumours or in survival studies.<br>OBJETIVO: Desenvolver um modelo para avaliar os efeitos do ultra-som focal pulsado como fonte de calor para o tratamento de tumores de Walker subcutâneos implantados em ratos. MÉTODOS: Um estudo experimental, controlado, comparativo foi realizado. Vinte ratos Wistar machos (160-300 g) divididos em dois grupos (G-1: Controle e G-2: hipertermia) foram inoculados com tumor de Walker carcinossarcoma-256. Após cinco dias os ratos do grupo G-2 ratos foram submetidos a hipertermia (45ºC). O calor foi aplicado diretamente no tumor por um equipamento de ultrassonografia (3 MHz, 1,5 W/cm³). A temperatura no tumor atingiu 45ºC em 3 minutos e foi mantida nesse nível por 5 minutos. O volume do tumor foi medido nos dias 5, 8, 11, 14 e 17 após a inoculação, em ambos os grupos. Teste t não pareado foi utilizado para comparação. P <0,05 foi considerado significante. RESULTADOS: O volume do tumor foi significativamente maior no 5º dia e diminuiu nos dias 11, 14 e 17 nos ratos tratados. Animais submetidos à hipertermia sobreviveram mais tempo que os animais do grupo controle. No 29º dia após a inoculação do tumor, 40% dos ratos do grupo controle e 77,78% dos ratos tratados com hipertermia permaneceram vivos. CONCLUSÃO: Os resultados obtidos mostram que o modelo proposto é bastante simples e pode ser utilizado em laboratórios menos sofisticados para estudar os efeitos da hipertermia focal no tratamento dos tumores malignos implantados ou em estudos de sobrevida

L-alanyl-glutamine pretreatment attenuates acute inflammatory response in children submitted to palatoplasty Pré-tratamento com L-alanil-glutamina atenua a resposta inflamatória aguda em crianças submetidas à palatoplastia

PURPOSE: To evaluate the effects of L-alanyl-glutamine (L-Ala-Gln) pretreatment on oxidative stress, glycemic control and inflammatory response in children submitted to palatoplasty. METHODS: Thirty male children scheduled for routine palatoplasty, age range 2-10 years, were randomly assigned to 2 groups (n=15): Group A (saline, control) and Group B (L-Ala-Gln). Group A received normal saline 100 ml, delivered intravenously by infusion pump over 3 hours preceding surgical procedure. Group B was treated with L-Ala-Gln, 20% solution (0.5g/Kg), adding saline to complete 100ml. Peripheral venous blood samples were collected at 5 different time-points: T1- at the beginning of the study, 3 h prior to the surgical procedure; T2- at the end of the infusion (before the surgical procedure), T3- at the end of the surgical procedure, T4- 6 h postoperative and T5- 12 h postoperative. Parameters analyzed included glutathione (GSH), thiobarbituric acid reactive substances (TBARS), glucose, insulin, C-reactive protein (CRP) and interleukin-6 (IL-6). RESULTS: No statistically significant differences were found between groups comparing glucose, insulin, TBARS, GSH and IL-6 levels. However, glucose levels increased (P <0.001) in T4 and T5 as compared to baseline (T1) in control group as opposed to L-Ala-Gln group. IL-6 increased in both groups during the postoperative period, indicating an increased inflammatory response. L-Ala-Gln pretreatment did not suppress the increase of IL-6, but reduced the increase of postoperative CRP levels (T5, p <0.01). CONCLUSION: Pretreatment with L-Ala-Gln in children submitted to palatoplasty attenuates the inflammatory response in early post-operative period and promoted a better glycemic control.<br>OBJETIVO: Avaliar os efeitos do pré-tratamento com L-alanil-glutamina (L-Ala-Gln) sobre o estresse oxidativo, o controle glicêmico e a resposta inflamatória em crianças submetidas à palatoplastia. MÉTODOS: Trinta crianças do sexo masculino, agendadas para palatoplastia, faixa etária 2-10 anos, foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos (n = 15): Grupo A (salina, controle) e Grupo B (L-Ala-Gln). O grupo A recebeu solução salina 0,9% 100 ml, administrado por via intravenosa utilizando uma bomba de infusão durante 3 horas anteriores ao procedimento cirúrgico. O grupo B foi tratado com L-Ala-Gln, solução a 20% (0,5 g/kg), acrescentando soro fisiológico até completar 100 ml. Amostras de sangue venoso periférico foram coletadas em cinco momentos diferentes: T1 (3 h antes do procedimento cirúrgico); T2 (no final da perfusão), T3 (no final do procedimento cirúrgico), no pós-operatório, após 6 h (T-4) e 12 h (T5). Os parâmetros analisados foram a glutationa (GSH), ácido tiobarbitúrico (TBARS), glicose, insulina, proteína C-reativa (PCR) e interleucina-6 (IL-6). RESULTADOS: Não houve diferença significante entre os grupos comparando as concentrações de glicose, insulina, TBARS, GSH e IL-6. No entanto, os níveis de glicose aumentaram em T4 e T5, comparado ao basal (T1) (P <0,001) e a IL-6 aumentou em ambos os grupos durante o período pós-operatório, sinalizando o aumento da resposta inflamatória. O pré-tratamento com L-Ala-Gln não suprimiu o aumento de IL-6, mas reduziu o aumento pós-operatório de PCR (T5, p<0,01). CONCLUSÃO: O pré-tratamento com L-Ala-Gln em crianças submetidas à palatoplastia atenua a resposta inflamatória no período pós-operatório imediato, promovendo um melhor controle glicêmico

PanCD44 Immunohistochemical Evaluation in Prostatectomies from Patients with Adenocarcinoma

Introduction. CD44 has been proposed as a prognostic marker and a stem cell marker but studies in patients with prostate cancer have yielded inconsistent results. Patients and Methods. Patients submitted to radical prostatectomy between 2008 and 2013 at a university hospital were followed with biannual serum PSA tests to determine the biochemical recurrence (BR). Archived paraffin blocks with neoplastic and nonneoplastic tissue were evaluated immunohistochemically for a panCD44 and MYC. Results. Sixty-nine patients completed follow-up and were included. CD44 positivity was observed in inflammatory cells (42%), nonneoplastic epithelium (39.7%), and neoplastic tissue (12.3%). In nonneoplastic tissues staining was observed in basal and luminal cells with the morphology of terminally differentiated cells. In neoplastic tissues, CD44 negativity was correlated with higher Gleason scores (Rho = −0.204; p=0.042) and higher preoperative serum PSA levels when evaluated continuously (p=0.029). CD44 expression was not associated with tumor stage (p=0.668), surgical margin status (p=0.471), or BR (p=0.346), nor was there any association between CD44 and MYC expression in neoplastic tissue (p=1.0). Conclusion. In the bulk of cells, the minority of cancer stem cells would not be detected by immunohistochemistry using panCD44. As a prognostic marker, its expression was weakly correlated with Gleason score and preoperative PSA level, but not with surgical margin status, tumor stage, or BR