Heterologous expression and characterization of two toxins from Tityus serrulatus scorpion venom

Os escorpiões estão entre os animais peçonhentos mais antigos da Terra, existindo por mais de 400 milhões de anos. As peçonhas desses animais contêm uma mistura complexa de proteínas e peptídeos capazes de interagir com alta complexidade no organismo de suas vítimas. No Brasil, o principal gênero de escorpião responsável pelos acidentes é o gênero Tityus, no qual estão inseridas as espécies T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus e T. stigmurus. A peçonha do T. serrulatus é composta em sua maioria de peptídeos com ação em canais para sódio e potássio, mas possuem também enzimas como hialuronidases, proteases e outros compostos como hipotensinas, peptídeos antimicrobianos (PAMs) e peptídeos potenciadores de bradicinina. Muitos dos componentes encontrados nas peçonhas de escorpiões têm sido estudados por possuírem importantes atividades farmacológicas, como propriedades analgésicas, antimicrobianas, antitumorais e anti-inflamatórias. Todavia, sabe-se que há uma grande dificuldade na obtenção dessas substâncias em consequência do baixo rendimento dos componentes isolados a partir da peçonha. Com isso, atualmente, tem sido utilizada a expressão heteróloga de proteínas para viabilizar a obtenção de toxinas em quantidades suficientes para uso biotecnológico. Diante desse panorama, o presente trabalho teve como objetivo a expressão de dois peptídeos presentes na peçonha de Tityus serrulatus, bem como sua comparação com os peptídeos nativos com relação à sua estrutura e atividade funcional. As toxinas escolhidas foram a Ts8 e a Ts8-propeptídeo, também chamada de scorpine-like, que atuam em canais para potássio (KTxs). As sequências e os cDNAs moldes das toxinas expressas foram obtidos da biblioteca de cDNA da glândula de Tityus serrulatus construída em nosso laboratório. Os genes sintéticos contendo as toxinas de interesse foram transformados em células de Pichia pastoris da linhagem KM71H. A expressão das Ts8 e Ts8-propeptídeo recombinantes revelou a presença das toxinas, porém as mesmas sofreram degradação proteolítica por enzimas da P. pastoris. Dessa forma, foram realizadas as avaliações das expressões na presença de substrato como os casaminoácidos, bem como na diminuição do pH, temperatura e adição de inibidores de protease. Além disso, foi possível obter a rTs8, embora clivada, com atividade sobre canais para potássio. Novas etapas de purificação em colunas de troca iônica e fase reversa foram padronizadas para a obtenção das toxinas nativas a partir da peçonha de T. serrulatus. Adicionalmente, foi possível identificar a presença da Ts8 e Ts8-propeptídeo (scorpine-like) nativas por espectrometria de massas em uma das frações obtidas da cromatografia da peçonha. A adição de casaminoácidos foi favorável para a expressão das toxinas, porém não foi suficiente para minimizar a degradação proteolítica. Ensaios funcionais com os fragmentos das toxinas recombinantes e com as toxinas nativas demonstraram a liberação de citocinas como TNF-? e IL1-? em algumas das toxinas testadas. Além disso, as toxinas demonstraram inibir o crescimento da Pichia pastoris em teste antifúngico e não foram tóxicas para células de macrófagos alveolares nas concentrações testadas. Assim, esse trabalho contribuiu para demonstrar a atividade de enzimas proteolíticas na expressão em P.pastoris, avaliar as condições em que são liberadas, bem como demonstrar a atividade da rTs8 em ensaio eletrofisiológico e a atividade antifúngica das toxinas recombinantes e nativas.Scorpions are among the oldest venomous animals on Earth, existing for over 400 million years. The venoms of these animals contain a complex mixture of proteins and peptides that can interact with high complexity with their victims. In Brazil, the main genus of scorpions responsible for accidents is Tityus genus, in which the species T. serrulatus, T. bahiensis, T. obscurus and T. stigmurus are inserted. T. serrulatus venom (Tsv) is composed mostly of peptides with action on sodium and potassium channels, but also have enzymes such as hyaluronidases, proteases and other compounds such as hypotensins, antimicrobial peptides (AMPs) and bradykinin potentiating peptides. Many of the components found in scorpion venoms have been studied for their important pharmacological activities, such as analgesic, antimicrobial, antitumor and anti-inflammatory properties. However, it is known that there is great difficulty in obtaining these substances because of the low yield of the isolated components from the venom. With this, the heterologous expression of proteins has been used to enable the production of toxins in sufficient amount for biotechnological purpose. In this panorama, the aim of this study is the expression of two peptides present in the venom of Tityus serrulatus, as well as their comparison with the native peptides in relation to their structure and functional activity. The toxins chosen were Ts8 and Ts8-propeptide, also called scorpine-like, acting on potassium channels (KTxs). Sequences and cDNAs templates of the expressed toxins were obtained from the cDNA library of the Tityus serrulatus gland constructed in our laboratory. Synthetic genes containing the toxins of interest were transformed into Pichia pastoris cells of strain KM71H. Expression of the recombinant Ts8 and Ts8-propeptide revealed the presence of the toxins, but they underwent proteolytic degradation by P. pastoris enzymes. Thus, we evaluate the expression in the presence of substrate as the casamino acids, as well as in the decrease of pH, temperature and addition of protease inhibitors. In addition, rTs8, although cleaved, could be obtained with potassium channel activity. New purification steps in ion exchange and reverse phase columns were standardized to obtain the native toxins from the venom of T. serrulatus. In addition, it was possible to identify the presence of native Ts8 and Ts8-propeptide (scorpine-like) by mass spectrometry in one of the fractions obtained from the venom chromatography. The addition of casamino acids was favourable for toxin expression, but was not sufficient to minimize proteolytic degradation. Functional assays with recombinant toxin fragments and native toxins have demonstrated the release of cytokines such as TNF-? and IL-1? in some of the toxins tested. In addition, the toxins were shown to inhibit the growth of Pichia pastoris in the antifungal test and were not toxic to alveolar macrophages cells at the concentrations tested. Thus, this work contributed to demonstrate the activity of proteolytic enzymes in P.pastoris expression, to evaluate the conditions under which they are released, as well as to demonstrate the activity of rTs8 in the electrophysiological assay and the antifungal activity of recombinant and native toxin

Isolation, structural and biochemical characterization of a new phospholipase A2 from Lachesis muta rhombeata venom

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos.Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development

Isolation, structural and biochemical characterization of a new phospholipase A2 from Lachesis muta rhombeata venom

As serpentes contêm em sua peçonha inúmeras substâncias que vão desde componentes inorgânicos até proteínas complexas com diferentes atividades sobre diversos sistemas fisiológicos. As serpentes do gênero Lachesis estão distribuídas na floresta tropical da América Central e do Sul, incluindo o Brasil. Entre as substâncias encontradas na peçonha dessas serpentes estão as fosfolipases A2 (PLA2), que constituem uma família de enzimas que catalisam a hidrólise da ligação éster sn-2 em glicerofosfolipídeos e exibem uma variedade de atividades fisiológicas e patológicas, incluindo neurotoxicidade pré e pós-sináptica. Elas induzem a formação de edema, afetam a agregação plaquetária, além de serem potentes promotores de inflamação. Os objetivos desse trabalho foram o isolamento, a caracterização estrutural e bioquímica de uma nova PLA2 presente na peçonha de Lachesis muta. A peçonha foi submetida a uma filtração em gel em coluna HiPrep Sephacryl S200, obtendo-se as frações LmS-A a LmS-K. As frações LmS-G, LmS-H e Lms-I apresentaram elevada atividade fosfolipásica, com destaque para a fração LmS-G, que foi então submetida a uma cromatografia de fase reversa, obtendo-se um pico majoritário denominado Lmr-PLA2. A sequência de aminoácidos da Lmr-PLA2 apresentou alta identidade com PLA2s já descritas na literatura, porém, com alguns resíduos distintos, caracterizando-a como uma nova PLA2. Além disso, a enzima possui o resíduo D49 na sua sequência de aminoácidos, sugerindo ser uma PLA2 cataliticamente ativa, confirmado pelo ensaio de atividade hemolítica indireta. A massa molar determinada por espectrometria de massas foi de 13,9 kDa. Através de eletroforese bidimensional, foi determinado o ponto isoelétrico de 5,49, indicando ser uma PLA2 ácida. Os parâmetros cinéticos obtidos foram velocidade máxima (Vmax) e a constante de Michaelis (Km) de 1,147 nmol/min/mL e 0,404 mM além de Kcat = 0,41 min-1, ou número de turnover, e a eficiência catalítica Kcat/Km= 1,02 mM-1min-1 sobre o substrato NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid). A Lmr-PLA2 inibe a agregação plaquetária, é edematogênica, mas não é miotóxica. Os níveis plasmáticos de creatina cinase, proteínas, ureia e ?-glutamiltranspeptidase de camundongos que receberam injeção de Lmr-PLA2 não foram alterados. Estes dados juntamente com as análises de miotoxicidade demonstraram que a enzima tem baixa toxicidade in vivo. A elevada atividade catalítica e baixa toxicidade da Lmr-PLA2 tornam esta molécula promissora para o desenvolvimento de fármacos.Snakes contain numerous substances in their venom ranging from inorganic to complex proteins with different activities on various physiological systems. Snakes of the genus Lachesis are distributed in the rainforest of Central and South America, including Brazil. Among the substances found in the venom of these snakes are phospholipases A2 (PLA2), which constitute a family of enzymes that catalyze the hydrolysis of the sn-2 ester bond in glycerophospholipids and exhibit a variety of physiological and pathological activities, including neurotoxicity pre- and post-synaptic. They induce the formation of edema, affect platelet aggregation and are potent promoters of inflammation. The objectives of this work are the isolation, structural and biochemical characterization of a new PLA2 present in the venom of Lachesis muta rhombeata. The role venom was subjected to gel filtration in Sephacryl S200, obtaining fractions LMS-A to LMS-K. The fractions LMS-G, LMS-H and LMS-I exhibited phospholipase activity, particularly the fraction LMS-G, which was then subjected to reversed phase chromatography, yielding a majority peak called Lmr-PLA2. The amino acid sequence of Lmr-PLA2 showed high identity with PLA2s already described in the literature, but with some distinct residues, characterizing it as a new PLA2. Additionally, this enzyme possesses the residue D49 in its amino acid sequence, indicating that one catalytically active PLA2 confirmed by indirect hemolytic activity. The molar mass determined by mass spectrometry was 13.9 kDa and its isoelectric point 5.49, indicating that Lm-PLA2 is an acid phospholipase. The kinetic parameters were Vmax = 1.147 nmol/min/mL and Km = 0.404 mM; Kcat = 0.41 min-1, or turnover number, e a catalytic efficiency, Kcat/Km = 1.02 mM-1min-1 with NOB (3-(octanoyloxy)benzoic acid) substrate. Lmr-PLA2 inhibits platelet aggregation, causes edema, but it is not myotoxic. Plasma levels of creatine kinase, protein, urea and ?-glutamyltranspeptidase of mice injected with Lmr-PLA2 have not changed. These data together with myotoxicity analysis showed that the enzyme has low toxicity in vivo. The high catalytic activity and low toxicity of Lmr-PLA2 make this molecule promising for drug development

Purification and enzymatic characterization of a novel metalloprotease from Lachesis muta rhombeata snake venom

Abstract Background Lachesis muta rhombeata (Lmr) is the largest venomous snake in Latin America and its venom contains mainly enzymatic components, such as serine and metalloproteases, L-amino acid oxidase and phospholipases A2. Metalloproteases comprise a large group of zinc-dependent proteases that cleave basement membrane components such as fibronectin, laminin and collagen type IV. These enzymes are responsible for local and systemic changes, including haemorrhage, myonecrosis and inflammation. This study aimed the isolation and enzymatic characterization of the first metalloprotease (Lmr-MP) from Lmr venom (LmrV). Methods and results Lmr-MP was purified through two chromatographic steps and submitted to enzymatic characterization. It showed proteolytic activity on azocasein with maximum activity at pH 7.0–9.0. It was inhibited by EDTA (a metal chelator that removes zinc, which is essential for enzymatic activity) and no effect was observed with PMSF, iodoacetic acid or pepstatin (inhibitors of serine, cysteine and aspartyl proteases, respectively). Ca2+, Mg2+ and Ba2+ ions increased its activity, while Al3+, Cu2+, Ni2+ and Zn2+ inhibited it. Additionally, ZnCl2 showed a dose dependent inhibition of the enzyme. Lmr-MP activity was also evaluated upon chromogenic substrates for plasma kallikrein (S-2302), plasmin and streptokinase-activated plasminogen (S-2251) and Factor Xa (S-2222) showing the highest activity on S-2302. The activity in different solutions (5 mM or 50 mM ammonium bicarbonate, pH 7.8; 0.1% trifluoroacetic acid + 50% acetonitrile; phosphate buffer saline, pH 7.4; 50 mM sodium acetate, pH 4.0 or ammonium acetate pH 4.5) was also evaluated and the results showed that its activity was abolished at acidic pHs. Its molecular mass (22,858 Da) was determined by MALDI-TOF and about 90% of its primary structure was verified by high-resolution mass spectrometry using HCD and ETD fragmentations and database search against the sequence of closely related species. It is a novel enzyme which shared high identity with other snake venom metalloproteases (svMPs) belonging to the P-I group. Conclusion The purification procedure achieved a novel pure highly active metalloprotease from LmrV. This new molecule can help to understand the metalloproteases mechanisms of action, the Lachesis envenoming, as well as to open new perspectives for its use as therapeutic tools

Heterologous expression of Ts8, a neurotoxin from Tityus serrulatus venom, evidences its antifungal activity.

peer reviewedIn this study we expressed the Ts8, a neurotoxin from Tityus serrulatus scorpion venom, in Pichia pastoris yeast. We evaluated the peptide expression in different conditions, such as pH, temperature, and addition of casamino acids supplement. Analyses of expressed products by mass spectrometry and Edman degradation showed that rTs8 has sites that allow its cleavage by yeast proteases released into the culture medium. The casamino acids addition was favourable for toxin expression, however, was not sufficient to minimize proteolytic degradation. Functional assays with recombinant toxin fragments and native toxins have demonstrated the release of cytokines such as TNF-α and IL-1β in some peptides tested. In addition, the toxins were shown to inhibit the Pichia pastoris growth in antifungal test and were not toxic to alveolar macrophages cells at the concentrations analyzed The electrophysiological screening, by voltage clamp technique, showed that the rTs8 fragment with the highest molecular weight inhibited the Kv1.3 channel, whereas the N-terminal fragment had no activity on the ion channels tested