In vivo and in vitro activity of isolated compounds from Brazilian propolis on the modulation of the inflammatory process

Orientador: Pedro Luiz RosalenTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade e possíveis mecanismos de ação dos compostos isolados de própolis brasileiras sobre a modulação do processo inflamatório. As atividades anti-inflamatórias dos compostos vestitol e neovestitol, isolados da própolis vermelha brasileira e do cinamoiloxi-mammeisina (CNM), isolado da geoprópolis de Melipona scutellaris, foram avaliadas e os seguintes resultados obtidos: 1) O composto vestitol apresentou atividade inibitória sobre a migração de neutrófilos induzido por LPS ou mBSA, bem como sobre a liberação das quimiocinas CXCL1/KC e CXCL2/MIP-2 in vivo e in vitro. Foi também observado que o tratamento com vestitol reduziu o rolamento e adesão de leucócitos na microcirculação mesentérica de camundongos. Quanto à sua atividade em neutrófilos in vitro, o vestitol reduziu a quimiotaxia de neutrófilos induzida por CXCL2/MIP-2 e LTB4 e bloqueou o influxo de cálcio nestas células. Não foi constatada alteração da expressão do receptor CXCR2 com o pré-tratamento de vestitol. 2) Em relação ao composto neovestitol, foi verificada que a sua administração reduziu a migração de neutrófilos, o rolamento e adesão de leucócitos e a expressão de ICAM-1 em camundongos desafiados com LPS. No que diz respeito à liberação de TNF-?, CXCL1/KC e CXCL2/MIP-2, não foi constatada atividade do neovestitol sobre estes mediadores inflamatórios. Além disso, o composto não alterou a expressão de ICAM-1 in vitro. Por outro lado, foi observado que a administração de um inibidor da óxido nítrico sintetase, aboliu o efeito anti-inflamatório do neovestitol sobre a migração de neutrófilos. No modelo de artrite induzida por colágeno, a administração diária do neovestitol pelo período de 12 dias, reduziu o escore clinico de artrite dos animais, as lesões articulares e a liberação de IL-6. 3) Em relação aos resultados obtidos com o composto CNM, foi observado que a sua administração reduziu a migração de neutrófilos na cavidade peritoneal e articular, bem como a liberação de TNF-? e CXCL2/MIP-2 in vivo e in vitro. Foi verificado também, que o CNM reduziu a expressão das proteínas fosforiladas ERK 1/2, JNK, p38 MAPK e c-jun em macrófagos RAW 264.6. Da mesma forma, o CNM reduziu a ativação de NF-?B, entretanto, não alterou a degradação de I?B? e a translocação de p65 nuclear. Portanto, conclui-se que a própolis brasileira é uma importante fonte de compostos ativos com potencial biológico e que os compostos isolados delas como vestitol, neovestitol e CNM, são promissores agentes anti-inflamatórios com mecanismos distintos e de interesses para os desfechos de processos inflamatórios agudos ou crônicos, com possibilidades de uso terapêuticoAbstract: The objective of this study was to evaluate the activity and possible mechanisms of action of compounds isolated from Brazilian propolis on modulation of the inflammatory process. The anti-inflammatory activities of vestitol and neovestitol, isolated from Brazilian red propolis and cinnamoyloxy-mammeisin (CNM), isolated from Melipona scutellaris geopropolis were evaluated and the following results were observed: 1) Vestitol had inhibitory activity against LPS or mBSA induced neutrophil migration as well as on the release of chemokines CXCL1/KC and CXCL2/MIP-2 in vivo and in vitro. It was also found that treatment with vestitol reduced leukocytes rolling and adhesion in mice mesenteric microcirculation. Regarding the activity on neutrophil in vitro, vestitol reduced CXCL2/MIP-2 and LTB4 induced neutrophils chemotaxis and blocked the calcium influx in these cells. No change was observed in CXCR2 receptor expression with vestitol pretreatment. 2) The administration of neovestitol reduced neutrophil migration, leukocytes rolling and adhesion and ICAM-1 expression in mice challenged with LPS. Despite the release of TNF-?, CXCL1/KC and CXCL2/MIP-2, we found no activity of neovestitol on these inflammatory mediators. Furthermore, the compound did not alter the in vitro ICAM-1expression. Moreover, it was observed that administration of a nitric oxide sintase inhibitor abolished the anti-inflammatory effect of neovestitol neutrophils migration. In the of collagen-induced arthritis model, it was found that the daily administration of neovestitol for 12 days, reduced the clinical arthritis score of the animals, joint injury and IL-6 release. 3) Regarding the results obtained with CNM, it was found that administration reduced neutrophil migration into the peritoneal and joint cavity, as well as TNF-? and CXCL2/MIP-2 release in vivo and in vitro. Concerning mechanism of action, it was found that CNM reduced the expression of the phosphorylated proteins ERK 1/2, JNK, p38 MAPK and c-jun in RAW 264.6 macrophages. Furthermore, it was observed that CNM reduced NF-kB activation, however, did not affect the I?B? degradation and p65 nuclear translocation. Thus, we conclude that Brazilian propolis is an important source of active compounds with biological potential. Also, some of isolated compounds such as vestitol, neovestitol and CNM are promising anti-inflammatory agents with distinct mechanisms of action with possible therapeutic use in acute or chronic inflammatory processesDoutoradoFarmacologia, Anestesiologia e TerapeuticaDoutor em Odontologia2012/01365-0, 2012/22378-2FAPES

Evaluation of anti-inflammatory and antinociceptive potential of geopropolis of Melipona scutellaris

Orientador: Pedro Luiz RosalenDissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de PiracicabaResumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade anti-inflamatória e antinociceptiva do extrato etanólico de geoprópolis (EEGP) de Melipona scutellaris e frações químicas, bem como possíveis mecanismos de ação. Além disso, caracterizar quimicamente o EEGP e frações bioativas. Para avaliação da atividade anti-inflamatória foram aplicados os ensaios de recrutamento de neutrófilos na cavidade peritoneal, microscopia intravital e edema de pata induzido por carragenina. A via do óxido nítrico (NO) foi avaliada através da administração de inibidores desta via, além da avaliação da expressão das moléculas de adesão intercelular tipo 1 (ICAM-1) e quantificação de nitritos. A análise química do EEGP e fração bioativa foram realizadas pelos métodos de cromatografia gasosa com espectrometria de massas (CG/EM) e cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). Para avaliação da atividade antinociceptiva, foram aplicados os ensaios de contorções abdominais induzida por ácido acético, teste da formalina, hipernocicepção inflamatória mecânica induzida por carragenina e quantificação das citocinas IL-1 ? e TNF-?. A composição química do EEGP e frações bioativas foram avaliadas pela quantificação de fenóis e flavonóides totais. Conforme os resultados nos ensaios anti-inflamatórios, foi verificado que o EEGP e sua fração aquosa diminuíram a migração de neutrófilos na cavidade peritoneal induzido por carragenina, como também diminuíram a interação dos leucócitos (rolamento e adesão) com as células endoteliais. A administração de inibidores da via do NO suprimiu a atividade inibitória do EEGP e da fração aquosa sobre a migração de neutrófilos. A expressão de ICAM-1 apresentou-se diminuída, e os níveis de nitritos aumentados após o tratamento com EEGP e fração aquosa. No modelo de edema de pata induzido por carragenina, o EEGP e a fração aquosa apresentaram atividade anti-edematogênica. Nenhum padrão de ácido fenólico ou flavonóide, comumente encontrado em amostra de própolis de Apis mellifera, pôde ser detectado nas amostras de EEGP e da fração aquosa pelas técnicas de CG/EM e CLAE-FR. Nos ensaios de atividade antinociceptiva foi verificado que o EEGP e as frações hexânica e aquosa diminuíram o número de contorções abdominais induzida por ácido acético. No teste da formalina, o EEGP e a fração aquosa inibiram ambas as fases (neurogênica e inflamatória), e a fração hexânica apenas a fase neurogênica. Foi evidenciada atividade do EEGP e fração aquosa na hipernocicepção inflamatória mecânica induzida por carragenina, como também foi constatado níveis diminuídos de IL-1? e TNF-?. Para as amostras de EEGP e frações hexânica e aquosa foi verificada a presença de compostos fenólicos e ausência de flavonóides. Estes resultados indicam que as frações bioativas encontradas possuem substâncias promissoras como novos agentes terapêuticos para o controle da inflamação e dorAbstract: The aim of this study was to evaluate the anti-inflammatory and antinociceptive geopropolis of ethanolic extract (EEGP) of Melipona scutellaris and fractions, as well as a possible mechanism of actions. In addition, to characterize chemically EEGP and bioactive fractions. To evaluate the anti-inflammatory activity we used the recruitment of neutrophils into the peritoneal cavity, intravital microscopy and paw edema induced by carrageenan. The pathway of nitric oxide (NO) was demonstrated by administration of antagonists of this pathway, but also evaluated by the expression of intercellular adhesion molecule type 1 (ICAM-1) and quantification of nitrites. Reversed-phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) and gas chromatography/mass spectrometry (GC/MS) were used the phytochemical analyses. The tests used to evaluate the antinociceptive activity were abdominal contortions induced by acetic acid, formalin test, carrageenan-induced mechanical inflammatory hypernociception and quantification of IL-1 ? and TNF-?. The quantification of total phenols and flavonoids was also determined in the EEGP and the bioactive fractions. In the anti-inflammatory tests the EEGP and the aqueous fraction decreased the neutrophil migration into the peritoneal cavity induced by carrageenan and also decreased the interaction of leukocytes (rolling and adhesion) with endothelial cells. The route of administration of inhibitors of NO abolished the inhibitory activity of the aqueous fraction and EEGP on neutrophil migration. The expression of ICAM-1 was reduced and nitrite levels increased after treatment with EEGP and aqueous fraction. In the paw edema induced by carrageenan, both EEGP and aqueous fraction showed anti-edema activity. No standards of flavonoid or phenolic acid commonly found in a sample of propolis of Apis mellifera could be detected in any samples of aqueous fraction or EEGP by GC/MS and RP-HPLC techniques. In tests to evaluate the antinociceptive activity was determined that EEGP, hexane and aqueous fractions decreased the number of abdominal constrictions induced by acetic acid. In the formalin test, the aqueous fraction and EEGP inhibited both phases (neurogenic and inflammatory), and the hexane fraction only neurogenic phase. The EEGP and the aqueous fraction showed activity in the carrageenan-induced mechanical inflammatory hypernociception model, as also observed decreased levels of IL-1? and TNF-?. The EEGP, hexane and aqueous fractions was verified the presence of phenolic compounds and absence of flavonoids. These results indicate that the bioactive fractions in the present study showed substances that could be promising new therapeutic agents to control inflammation and painMestradoFarmacologia, Anestesiologia e TerapeuticaMestre em Odontologi