GFP transgene driven by Kit proto-oncogene regulatory sequences is differentially expressed in multiple stem and progenitor cells

Nel corso degli ultimi anni, numerosi geni regolatori dello sviluppo embrionale e della differenziazione cellulare si sono rivelati importanti mediatori della tumorigenesi. Lo studio di questi geni ha inoltre evidenziato l’esistenza di meccanismi comuni nella regolazione di diversi sistemi differenziativi, tuttavia ancora poco si conosce della loro funzione ed interazione. Una migliore comprensione dei meccanismi d’azione e delle relazioni fra geni regolatori è quindi fondamentale per chiarire anche la loro possibile implicazione in processi patologici. Il mio progetto di tesi di Dottorato si è inserito nel contesto di ricerca del laboratorio diretto dalla Dr.ssa Maria Cristina Magli che si interessa da diversi anni della funzione di alcuni di questi geni nell’ematopoiesi ed in altri sistemi cellulari, in particolare a livello di cellule staminali e progenitori. Durante la mia tesi ho sviluppato una serie di studi sul ruolo di Kit, un protoncogene che codifica il recettore tirosin-chinasico per il fattore di crescita Stem Cell Factor (SCF). Il pathway regolativo SCF/Kit riveste un ruolo chiave nella regolazione di diversi tipi di cellule staminali come le ematopoietiche, germinali e cardiache. Inoltre Kit è espresso anche nell’intestino, a livello delle cellule interstiziali di Cajal, e recentemente è stato evidenziato per Kit un’attività oncogenica nello sviluppo dei tumori stromali gastro-intestinali (Gastrointestinal stromal tumors; GISTs). Al fine di studiare la regolazione e la funzione di Kit ho utilizzato una linea transgenica murina, generata nel laboratorio diretto dal Prof. Sergio Ottolenghi, nella quale il gene repoter “enhanced green fluorescent protein (GFP)” è espresso sotto il controllo di regioni di regolazione di Kit. Il primo obiettivo della mia tesi è stato verificare se il transgene Kit/GFP sia espresso nelle cellule staminali ematopoietiche (HSC) del midollo osseo (BM) e del fegato fetale. Tramite analisi citofluorimetriche, saggi clonogenici e saggi di ripopolazione in vivo, ho dimostrato che il transgene è efficientemente espresso nelle HSC sia durante lo sviluppo embrionale che nella vita adulta. Inoltre, i risultati da me ottenuti forniscono la prima evidenza funzionale di una espressione differenziale di Kit nelle HSC rispetto ai progenitori ematopoietici, riproducendo quindi i pattern di espressione di altri importanti marcatori di cellule staminali. Questi risultati, in aggiunta ai dati precedentemente ottenuti riguardo alla espressione del transgene in altri tipi di cellule staminali e progenitori, dimostrano che il transgene contiene le regioni regolatorie necessarie per una corretta espressione che ricapitola l’espressione del gene Kit endogeno. Per queste ragioni, il nostro modello transgenico può essere considerato un prezioso sistema in vivo per “monitorare” cellule staminali e progenitori durante lo sviluppo e la rigenerazione tissutale. In quest’ottica, il modello Kit/GFP è stato da me impiegato per analizzare il trafficking fra midollo osseo e cuore in seguito ad infarto miocardico (MI). Infatti, il secondo obiettivo della mia tesi e’ stato determinare se cellule del BM possano contribuire a ripopolare il pool di cellule staminali cardiache Kit+ in seguito a MI. A tal fine abbiamo trapiantato midollo Kit/GFP in animali riceventi wild type che, a distanza di quattro mesi, sono stati sottoposti a infarto miocardico. Dopo 2-3 settimane gli espianti cardiaci sono stati cresciuti in vitro; nelle colture cellulari derivate dai cuori infartuati abbiamo evidenziato la presenza di cellule GFP+ capaci di proliferare estesamente e di generare "cardiosfere", ovvero strutture contenenti cellule staminali cardiache, progenitori e cellule differenziate. Tutte le cardiosfere derivate da cuori infartuati sono risultate fluorescenti, cioè derivate dal midollo osseo trapiantato. Le stesse cardiosfere si sono inoltre dimostrate capaci di differenziare in cellule cardiache in vitro e in vivo, se iniettate in topi riceventi secondari wild type sottoposti a MI. Questi risultati indicano che, almeno in seguito a un danno a livello cardiaco, cellule derivate dal midollo osseo possono migrare nel tessuto cardiaco danneggiato e generare cellule con proprietà analoghe a quelle delle cellule staminali cardiache "endogene". In conclusione, il nostro modello transgenico Kit/GFP costutuisce un potente strumento per lo studio delle dinamiche differenziative delle cellule staminali dei tessuti normali e patologici in cui il pathway Kit/SCF riveste una fondamentale funzione regolativa

Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis

Otx1 belongs to the paired class of homeobox genes and plays a pivotal role in brain development. Here, we show that Otx1 is expressed in hematopoietic pluripotent and erythroid progenitor cells. Moreover, bone marrow cells from mice lacking Otx1 exhibit a cell-autonomous impairment of the erythroid compartment. In agreement with these results, molecular analysis revealed decreased levels of erythroid genes that include the SCL and GATA-1 transcription factors. Accordingly, a gain of function of SCL rescues the erythroid deficiency in Otx1-/- mice. Taken together, our findings indicate a function for Otx1 in the regulation of blood cell production. There is growing evidence suggesting that common cellular and molecular mechanisms orchestrate differentiation in various tissues. Homeobox-containing genes seem to be strong candidate genes to regulate a number of developmental processes, including neurogenesis and hematopoiesis. Members of the Otx family (Otx1, Otx2, Otx3, and Crx) are the vertebrate homologues of the Drosophila head gap gene orthodenticle and encode transcription factors containing a bicoid-like homeodomain. They are temporally and spatially regulated during development and seem to be required for proper head and sense organ patterning. Otx1, Otx2, and Otx3 show partially overlapping, but distinct expression patterns, and Otx2, the first to be activated during development, plays a major role in gastrulation and in the early specification of the anterior neural plate. In contrast, Otx1 shows a later onset and is involved in corticogenesis, sense organ development, and pituitary function. Mice bearing targeted deletion of Otx1 are affected by a permanent epileptic phenotype and show multiple brain abnormalities and morphological defects of the acoustic and visual sense organs. In addition, at the prepubescent stage, they exhibit transient dwarfism and hypogonadism because of low levels of pituitary hormones. In the present study, we have investigated whether Otx1 also plays a role in blood cell production, as several homeobox genes of different families are involved in normal and/or malignant hematopoiesis

Functional microRNA screening using a comprehensive lentiviral human microRNA expression library

ABSTRACT: BACKGROUND: MicroRNAs (miRNAs) are a class of small regulatory RNAs that target sequences in messenger RNAs (mRNAs) to inhibit their protein output. Dissecting the complexities of miRNA function continues to prove challenging as miRNAs are predicted to have thousands of targets, and mRNAs can be targeted by dozens of miRNAs. RESULTS: To systematically address biological function of miRNAs, we constructed and validated a lentiviral miRNA expression library containing 660 currently annotated and 422 candidate human miRNA precursors. The miRNAs are expressed from their native genomic backbone, ensuring physiological processing. The arrayed layout of the library renders it ideal for high-throughput screens, but also allows pooled screening and hit picking. We demonstrate its functionality in both short- and long-term assays, and are able to corroborate previously described results of well-studied miRNAs. CONCLUSIONS: With the miRNA expression library we provide a versatile tool for the systematic elucidation of miRNA function.

Green fluorescent protein transgene driven by Kit regulatory sequences is expressed in hematopoietic stem cells

The expression of Kit in multiple types of stem cells suggests that common transcriptional programs might regulate this gene in different stem cells. In this work, the authors used mouse lines expressing transgenic green fluorescent protein under the control of Kit promoter/first intron regulatory elements. This study provides the basis for the elucidation of DNA sequences regulating a stem cell gene in multiple types of stem cells

Unsuspected role of the brain morphogenetic gene Otx1 in hematopoiesis

Otx1 belongs to the paired class of homeobox genes and plays a pivotal role in brain development. Here, we show that Otx1 is expressed in hematopoietic pluripotent and erythroid progenitor cells. Moreover, bone marrow cells from mice lacking Otx1 exhibit a cell-autonomous impairment of the erythroid compartment. In agreement with these results, molecular analysis revealed decreased levels of erythroid genes that include the SCL and GATA-1 transcription factors. Accordingly, a gain of function of SCL rescues the erythroid deficiency in Otx1(-/-) mice. Taken together, our findings indicate a function for Otx1 in the regulation of blood cell production

EHA evaluation of the ESMO-Magnitude of Clinical Benefit Scale version 1.1 (ESMO-MCBS v1.1) for haematological malignancies.

OBJECTIVE: Value frameworks in oncology have not been validated for the assessment of treatments in haematological malignancies, but to avoid overlaps and duplications it appears reasonable to build up experience on existing value frameworks, such as the European Society for Medical Oncology-Magnitude of Clinical Benefit Scale (ESMO-MCBS). METHODS: Here we present the results of the first feasibility testing of the ESMO-MCBS v1.1 for haematological malignancies based on the grading of 80 contemporary studies for acute leukaemia, chronic leukaemia, lymphoma, myeloma and myelodysplastic syndromes. The aims were (1) to evaluate the scorability of data, (2) to evaluate the reasonableness of the generated grades for clinical benefit using the current version and (3) to identify shortcomings in the ESMO-MCBS v1.1 that require amendments to improve the efficacy and validity of the scale in grading new treatments in the management of haematological malignancies. RESULTS: In general, the ESMO-MCBS v1.1 was found to be widely applicable to studies in haematological malignancies, generating scores that were judged as reasonable by European Hematology Association (EHA) experts. A small number of studies could either not be graded or were not appropriately graded. The reasons, related to the differences between haematological and solid tumour malignancies, are identified and described. CONCLUSIONS: Based on the findings of this study, ESMO and EHA are committed to develop a version of the ESMO-MCBS that is validated for haematological malignancies. This development process will incorporate all of the usual stringencies for accountability of reasonableness that have characterised the development of the ESMO-MCBS including field testing, statistical modelling, evaluation for reasonableness and openness to appeal and revision. Applying such a scale will support future public policy decision-making regarding the value of new treatments for haematological malignancies and will provide insights that could be helpful in the design of future clinical trials