Determinación de xenobióticos y concentración de sustancias endógenas en matrices biológicas

1. Introducción o motivación de la tesis Esta Tesis Doctoral ha tenido como objeto de estudio el desarrollo y aplicación de nuevos y eficientes procesos de extracción de xenobióticos y substancias endógenas en matrices biológicas complejas, basados en química verde. Los métodos que se han desarrollado han pretendido extender la utilización tanto de la precipitación de proteínas séricas con acetonitrilo (PPT) como de los disolventes supramoleculares (SUPRAS) a aplicaciones veterinarias, forenses, clínicas y de seguridad y calidad alimentaria. 2. Contenido: La Memoria de esta Tesis Doctoral se ha estructurado en dos bloques, precedidos de una Introducción en la que se describen las nuevas estrategias de la Química Bioanalítica para la reducción del consumo de disolventes orgánicos en procesos de extracción analítica de substancias endógenas y xenobióticos en matrices biológicas. Asimismo, se ilustran los aspectos teóricos y prácticos de las dos metodologías extractivas aplicadas en esta Tesis (precipitación de proteínas con acetonitrilo y SUPRAS). Los contenidos de los dos bloques se especifican a continuación: Bloque A: Determinación de antioxidantes endógenos, con alta sensibilidad a la luz y al aire, a través una metodología basada en tratamiento de muestras con precipitación de proteínas y cromatografía de líquidos con detección UV. En este bloque se describe una metodología analítica para la determinación de β-caroteno, retinol y α-tocoferol en suero de burros y caballos y cuatro de sus diversas aplicaciones en clínica veterinaria (capítulos 1, 2, 3, 4). Este tratamiento de muestra consistió en la adición de 600 microlitros de acetonitrilo a 300 microlitros de suero, lo que resultó en la precipitación de las proteínas. El extracto así obtenido se secó y redisolvió en 150 microlitros de fase móvil para su posterior análisis mediante cromatografía de líquidos con detección UV. El método fue validado cumpliendo todos los requisitos internacionales requeridos. Bloque B: Plataformas analíticas independientes de la matriz y basadas en SUPRAS para la cuantificación de multicomponentes en multimatrices mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem. El objeto de las investigaciones presentadas en este bloque ha sido el desarrollo de metodologías innovadoras, basadas en SUPRAS, para la determinación de anfetaminas (capítulo 5), aminoácidos y oligopéptidos (capítulo 6) y antihelmínticos (capítulo 7) en muy diversas matrices biológicas. Como tratamiento de muestra se utilizaron dos SUPRAS diferentes: uno obtenido mediante la coacervación de disoluciones coloidales de micelas inversas de hexanol (capítulos 5 y 7), y un segundo formado por coacervación de ácido heptafluorobutírico (HFBA) en disoluciones acuosas ácidas (capítulo 6). Los dos SUPRAS estudiados presentaron propiedades de acceso restringido. En ambos casos se desarrollaron procedimientos generalizados que demostraron ser independientes de la matriz, y capaces de simplificar en una sola etapa todo el proceso de purificación y extracción (90%) mediante una relación muestra/ACN de 1:2, la posterior evaporación de la disolución resultante hasta sequedad, y la redisolución del extracto en fase móvil (relación muestra/solución de reconstitución de 2:1), han resultado en la eliminación del efecto matriz y garantizado el empleo de poco disolvente, el aumento del factor de pre-concentración y una óptima compatibilidad con el sistema UV •El método analítico desarrollado y empleado en los capítulos 1-4 ha sido totalmente validado siguiendo las líneas guías internacionales, obteniéndose valores óptimos de linealidad, sensibilidad, precisión y exactitud. Bloque B: Plataformas analíticas independientes de la matriz y basadas en SUPRAS para la cuantificación de multicomponentes en multimatrices mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem. •La extracción mediante SUPRAS basados en hexanol ha permitido obtener extracciones eficientes para analitos (anfetaminas y antihelmínticos) con características químico-físicas muy diferentes, gracias a la capacidad del SUPRAS de disolver solutos mediante un mecanismo mixto (interacciones de van der Waals, puentes de hidrógeno, interacciones polares, e interacciones π-catión). Además, estos SUPRAS han demostrado tener una aplicabilidad excelente (con eliminación de los interferentes endógenos) para numerosas matrices biológicas (suero, orina, saliva, sudor, leche materna, leche de vaca, pelo y uñas). Estos SUPRAS han demostrado ser disolventes “à la carte” que se pueden sintetizar de forma totalmente espontánea y directa en matrices liquidas. Además, tienen capacidad para actuar como materiales con propiedades de acceso restringido (RAM), o como agentes volátiles con propiedades de acceso restringido (RAMVOL- SUPRAS) si se añade al proceso una etapa de evaporación para la eliminación de los fosfolípidos. Gracias a esta propiedad, las moléculas de bajo peso molecular se solubilizan en el SUPRAS, mientras que interferentes como proteínas o polisacáridos están excluidos física (precipitación por THF) y/o químicamente (fenómenos de exclusión). Estos SUPRAS basados en hexanol han permitido la determinación de 5 anfetaminas en 7 matrices biológicas diferentes y 8 benzimidazoles antihelmínticos en leche de vaca mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS). Los límites de detección encontrados están, para todos los casos, por debajo de los límites legislados y pertinentes para cada analito. Se ha propuesto en esta Tesis, por primera vez, un SUPRAS basado en ácido heptafluorobutírico (HFBA) como disolvente alternativo para la extracción de analitos muy polares (aminoácidos y oligopéptidos), cuya extracción en muestras biológicas se considera una tarea muy compleja. Esta interesante capacidad de extracción está relacionada con la “polaridad hidrofóbica” que presentan los compuestos perfluorados. Así, este SUPRAS ha sido capaz extraer de con elevado rendimiento (recuperaciones>80%) 20 aminoácidos y 9 oligopéptidos con valores de D de hasta -3. Adicionalmente, se ha llevado a cabo también la determinación del oligopéptido Opiorfina en saliva, por inyección directa en LCMS/ MS del extracto del SUPRAS basado en HFBA. •Las metodologías analíticas de extracción/limpieza basadas en SUPRAS constan de una única etapa que permite tratar muestras de forma simple, en muy poco tiempo, y empleando poca cantidad de muestra y de disolventes orgánicos (tiempo 15-35 min, muestra ≤ 1 mL, disolvente orgánico <2 mL). Por estos motivos, estas metodologías basadas en SUPRAS pueden encuadrarse dentro de la química analítica verde. •Las tres metodologías basadas en SUPRAS han sido totalmente validadas siguiendo los parámetros requeridos por las respectivas guías internacionales, obteniéndose valores óptimos de linealidad, sensibilidad, selectividad, precisión y exactitud

Latest Trends in Surface Modification for Dental Implantology: Innovative Developments and Analytical Applications

An increase in the world population and its life expectancy, as well as the ongoing concern about our physical appearance, have elevated the relevance of dental implantology in recent decades. Engineering strategies to improve the survival rate of dental implants have been widely investigated, focusing on implant material composition, geometry (usually guided to reduce stiffness), and interface surrounding tissues. Although efforts to develop different implant surface modifications are being applied in commercial dental prostheses today, the inclusion of surface coatings has gained special interest, as they can be tailored to efficiently enhance osseointegration, as well as to reduce bacterial-related infection, minimizing peri-implantitis appearance and its associated risks. The use of biomaterials to replace teeth has highlighted the need for the development of reliable analytical methods to assess the therapeutic benefits of implants. This literature review considers the state-of-the-art strategies for surface modification or coating and analytical methodologies for increasing the survival rate for teeth restoration.Ministerio de Ciencia e Innovación PID2019-109371GB-I00Junta de Andalucía PAIDI 2020, P20_00671Universidad de Sevilla US-1380878, PPI505/2020, PPI532/202

Novel Utilization of Therapeutic Coatings Based on Infiltrated Encapsulated Rose Bengal Microspheres in Porous Titanium for Implant Applications

Despite the increasing progress achieved in the last 20 years in both the fabrication of porous dental implants and the development of new biopolymers for targeting drug therapy, there are important issues such as bone resorption, poor osseointegration, and bacterial infections that remain as critical challenges to avoid clinical failure problems. In this work, we present a novel microtechnology based on polycaprolactone microspheres that can adhere to porous titanium implant models obtained by the spacer holder technique to allow a custom biomechanical and biofunctional balance. For this purpose, a double emulsion solvent evaporation technique was successfully employed for the fabrication of the microparticles properly loaded with the antibacterial therapeutic agent, rose bengal. The resulting microspheres were infiltrated into porous titanium substrate and sintered at 60 &deg;C for 1 h, obtaining a convenient prophylactic network. In fact, the sintered polymeric microparticles were demonstrated to be key to controlling the drug dissolution rate and favoring the early healing process as consequence of a better wettability of the porous titanium substrate to promote calcium phosphate nucleation. Thus, this joint technology proposes a suitable prophylactic tool to prevent both early-stage infection and late-stage osseointegration problems

The metabolic profile of Asinara (albino) and Sardo donkeys (pigmented) (Equus asinus L., 1758) points to unequivocal breed assignment of individuals

This study pointed to explore if variations in circulating levels of metabolites in the blood stream of no. 25 feral donkeys occur in view of the different coat color between specimens of Asinara (albino, no. 8) vs. Sardo (dun-grey, no. 17) breed. All individuals involved in this investigation are living in the nature, at Mediterranean latitudes and roam in the same areas all over the National Park of Capo Caccia, where they feed on spontaneous vegetation sources. The study was conducted during the positive photoperiod of the boreal hemisphere (peak in the month of June, 2019) to maximize the effect of exposure to the natural sun radiation and thus elicit the coping ability of albino (Asinara) in comparison with pigmented donkeys (Sardo). The biochemical profile of all donkeys was used in a Discriminant Analysis (DA) to explore if circulating levels of metabolites could point to metabolic markers for breed assignment of individuals following a canonical discriminant analysis (CANDISC). The biochemical investigation included also the determination of the circulating Vitamin E (alpha tocopherol, α-TOH), as an essential biologically active compound involved in antioxidant mechanisms, and its respective status (circulating α-TOH to total triglycerides and total cholesterol ratio). In the CANDISC, the distance between the two breeds was not significant. However, it pointed to different metabolites (UREA, total protein, total triglycerides, Zn) capable of describing biochemical patterns on each respective breed (Asinara vs. Sardo). The multivariate analysis DA carried out using 22 metabolites correctly assigned individuals to the two breeds in the 100% of cases. In view of such metabolic background, circulating α-TOH found in the bloodstream of Asinara vs. Sardo donkeys under free grazing conditions turned out to reach similar values (2.114 vs. 1.872 µg/ml, respectively, p = 0.676). It is worth noting that significant differences were observed as to circulating lactate dehydrogenase (LDH, p = 0.022) levels, in association with increased creatine phosphokinase (CPK, p = 0.076), both above the upper limit of the physiological range reported in other donkey breeds, and found in the totality of Asinara (albino) donkeys solely, still apparently clinically healthy

Blood serum retinol levels in Asinara white donkeys reflect albinism‐induced metabolic adaptation to photoperiod at Mediterranean latitudes

Abstract Previous works on albinism form of Asinara white donkeys (Equus asinus) identified the mutation leading to the peculiar phenotype spread to all specimens of the breed. Inbreeding naturally occurred under geographic isolation, on Asinara Island, in the Mediterranean Sea. Albino individuals can be more susceptible to develop health problems when exposed to natural sun radiation. Alternative metabolic pathways involved in photoprotection were explored in this trial. Nutrition‐related metabolites are believed to contribute to the conservation of Asinara donkeys, in which melanin, guaranteeing photoprotection, is lacking. Biochemical profiles with particular focus on blood serum β‐carotene and retinol levels were monitored. Identical natural grazing conditions for both Asinara (albino) and Sardo (pigmented) donkey breeds were assured on same natural pastures throughout the experimental period. A comparative metabolic screening, with emphasis on circulating retinol and nutrient‐related metabolites between the two breeds, was carried out over one year. Potential intra‐ and interspecimen fluctuations of metabolites involved in photoprotection were monitored, both during negative and positive photoperiods. Differences (p = .064) between blood serum concentrations of retinol from Asinara versus Sardo breed donkeys (0.630 vs. 0.490 μg/ml, respectively) were found. Retinol levels of blood serum turned out to be similar in the two groups (0.523 vs. 0.493 μg/ml, respectively, p = .051) during the negative photoperiod, but markedly differed during the positive one (0.738 vs. 0.486, respectively, p = .016). Blood serum β‐carotene levels displayed to be constantly around the limit of sensitivity in all animals of both breeds. Variations in blood serum concentrations of retinol in Asinara white donkeys can reflect the need to cope with seasonal exposure to daylight at Mediterranean latitudes, as an alternative to the lack of melanin. These results may suggest that a pulsed mobilization of retinol from body stores occurs to increase circulating levels during positive photoperiod