The role of heparan sulfate maturation in cancer: A focus on the 3O-sulfation and the enigmatic 3O-sulfotransferases (HS3STs)

Heparansulfate (HS) modifications are master regulators of the cross-talk between cell and matrix and modulate the biological activity of an array of HS binding proteins, including growth factors and chemokines, morphogens and immunity cell receptors. This review will highlight the importance of HS maturation mediated by N-deactetylase/sulfotransferases, 2O- and 6O-sulfotransferases in cancer biology, and will focus on the 3O-sulfotransferases and on the terminal, rare 3O-sulfation, and their important but still enigmatic impact in cancer progression. The review will also discuss the molecular mechanisms of action of these HS modifications with regards to ligand interactions and signaling in the cancer process and their clinical significance

Xylosyltransferase-I Regulates Glycosaminoglycan Synthesis during the Pathogenic Process of Human Osteoarthritis

Loss of glycosaminoglycan (GAG) chains of proteoglycans (PGs) is an early event of osteoarthritis (OA) resulting in cartilage degradation that has been previously demonstrated in both huma and experimental OA models. However, the mechanism of GAG loss and the role of xylosyltransferase-I (XT-I) that initiates GAG biosynthesis onto PG molecules in the pathogenic process of human OA are unknown. In this study, we have characterized XT-I expression and activity together with GAG synthesis in human OA cartilage obtained from different regions of the same joint, defined as “normal”, “late-stage” or adjacent to “late-stage”. The results showed that GAG synthesis and content increased in cartilage from areas flanking OA lesions compared to cartilage from macroscopically “normal” unaffected regions, while decreased in “late-stage” OA cartilage lesions. This increase in anabolic state was associated with a marked upregulation of XT-I expression and activity in cartilage “next to lesion” while a decrease in the “late-stage” OA cartilage. Importantly, XT-I inhibition by shRNA or forced-expression with a pCMV-XT-I construct correlated with the modulation of GAG anabolism in human cartilage explants. The observation that XT-I gene expression was down-regulated by IL-1β and up-regulated by TGF-β1 indicates that these cytokines may play a role in regulating GAG content in human OA. Noteworthy, expression of IL-1β receptor (IL-1R1) was down-regulated whereas that of TGF-β1 was up-regulated in early OA cartilage. Theses observations may account for upregulation of XT-I and sustained GAG synthesis prior to the development of cartilage lesions during the pathogenic process of OA

Les enzymes de biosynthèse des glycosaminoglycanes (étude structurale et fonctionnelle de la [bêta]4GalT7 humaine et caractérisation moléculaire des mutations responsables du syndrome progéroide d'Ehlers-Danlos)

Les chaînes de glycosaminoglycanes (GAGs) des protéoglycanes (PGs) jouent un rôle majeur dans la régulation de multiples événements cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus. Des perturbations de la synthèse des GAGs sont impliquées dans des pathologies d'origine dégénérative, tumorale et génétique, tel que le syndrome progéroïde d'Ehlers-Danlos (ED). Ce déficit résulte de mutations de la [bêta]1,4-galactosyltransférase 7 ([bêta]4GalT7) humaine associées à des atteintes sévères du système musculo-squelettique. En effet, cette enzyme catalyse une étape essentielle de l?initiation de la synthèse des GAGs à partir de la protéine "core" des PGs et de xylosides exogènes. Notre travail a porté sur l'étude structure-fonction de la [bêta]4GalT7 recombinante humaine. Nous avons associé des approches in vitro et ex vivo afin d?explorer le rôle des acides aminés des motifs 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 et 257HLH259, strictement conservés au sein des [bêta]4GalTs. L'étude des conséquences de mutations systématiques sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la [bêta]4GalT7 recombinante a permis d'identifier des acides aminés essentiels du site actif. Nous avons montré que les résidus D165 et H257 forment des liaisons de coordination avec le cation Mn2+ et proposé le rôle du résidu D228 dans la catalyse. Nous avons mis en évidence un rôle central du résidu W224 dans les interactions avec les substrats donneur et accepteur. Nous avons également établi les bases moléculaires des mutations de la [bêta]4GalT7 associées au syndrome ED. Enfin, l'étude de mécanismes de régulation épigénétique des voies de biosynthèse des GAGs dans les cellules H-EMC-SS de chondrosarcome humain a mis en évidence une hyperméthylation spécifique des gènes de la famille des 3-O-sulfotransférases, associée à un phénotype invasif. L'ensemble de ce travail ouvre des perspectives vers de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le traitement des arthropathiesProteoglycans (PGs) and their glycosaminoglycan chains (GAGs), play a major role in the architecture of extracellular matrices and are implicated in numerous cell events. The impairment of GAG synthesis and sulfation is involved in degenerative, tumor and genetic diseases, such as the progeroid form of Ehlers-Danlos (ED) syndrome. This inherited disorder is due to mutations of human [bêta]4GalT7 ([bêta]4GalT7) causing a defect in GAG synthesis, associated with severe musculo-skeletal alterations. Indeed, this enzyme catalyzes a key step in GAG synthesis linked to the core protein of PGs and from exogenous xylosides. Our work has been focused on the structural and functional characterization of human recombinant [bêta]4GalT7 enzyme. We combined in vitro and ex vivo approaches to explore the role of amino acids located in 163DVD165, 221FWGWGREDDD230 and 257HLH259 motifs, which are highly conserved within [bêta]4GalTs. The study of the consequences of site-directed mutations on kinetic and functional properties of the [bêta]4GalT7 enzyme allowed us to identify key active site amino acids. Our results indicate that D165 and H257 residues form coordination bonds with Mn2+ divalent cations. Furthermore, we suggested a catalytic role for D228 residue and highlighted a central role of W224 residue via interactions with the donor and acceptor substrates. We also determined the molecular basis of [bêta]4GalT7 mutations associated with ED syndrome. Finally, the study of epigenetic regulation mechanisms by DNA methylation of GAG biosynthesis in human chondrosarcoma cells (H-EMC-SS) revealed the specific hypermethylation of the 3-O-sulfotransferase gene family, associated with the invasive phenotype of these cells. Together, this work paves the way towards innovative strategies in the treatment of arthropathiesNANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

Exploration des enzymes de biosynthèse des protéoglycanes et leurs altérations lors de pathologies articulaires

Dotés d une position stratégique à la surface des cellules et au sein des matrices extracellulaires, les PGs à héparane-sulfates (HS) jouent un rôle essentiel dans de multiples processus physiopathologiques en régulant l activité de nombreux médiateurs solubles. Les voies de biosynthèse des glycosaminoglycanes (GAGs) nécessitent l action coordonnée de glycosyltransférases (GTs) et sulfotransférases (STs). Bien que celles-ci soient en partie caractérisées, leurs mécanismes de régulation restent mal connus. Dans la première partie de notre travail, nous avons réalisé une étude structure-fonction de la ß1,4-galactosyltransférase 7 (ß4GalT7) qui catalyse une étape clé de l initiation des chaînes de GAG. Nous avons identifié deux motifs D163VD165 et 221FWGWGREDDE230 strictement conservés au sein des ß4GalTs. Une approche in vitro combinée à la mesure du taux de biosynthèse des PGs par incorporation de 35S ex vivo, a permis d évaluer l impact des mutations conservative et non conservative sur les propriétés cinétiques et fonctionnelles de la ß4GalT7. Nous avons ainsi pu cerner les résidus clés impliqués dans la reconnaissance des substrats donneur (UDP-galactose)/Mn2+, accepteur et la catalyse enzymatique. Dans un second temps, afin d explorer les mécanismes de régulation des voies de biosynthèse, nous avons examiné les régions situées en 5 des gènes codant les GTs et STs et mis en évidence une méthylation aberrante touchant en particulier la famille des 3-OSTs, dans les cellules de chondrosarcome humain H-EMC-SS (HEMC). Cette hyperméthylation provoque une diminution d expression de ces transcrits conduisant à une altération des chaînes de HS, restaurée par le traitement des cellules par un agent déméthylant, la 5-aza-2 déoxycytidine. Ce traitement ainsi que la surexpression des 3-OSTs par transfert de gène produit un ralentissement de la prolifération et motilité cellulaires et une augmentation de capacité d adhésion des cellules. Ces résultats soulignent l importance de l altération des chaînes de HS cellulaires dans le caractère invasif des HEMC et suggèrent que la 3-O-sulfatation est un facteur contribuant à ce processus. Nous avons montré pour la première fois que les gènes codant les ST à HS sont régulés par un mécanisme épigénétique dans les cellules HEMC. Ces résultats ouvrent la voie à une meilleure compréhension des pathologies articulaires d origine cancéreuse et permettent d envisager des stratégies thérapeutiques ciblant la méthylation de l ADN.Located at the cell-tissue-organ interface, heparan sulfate proteoglycans (HSPGs) facilitate ligand-receptor interactions crucial to many physiopathological processes. The synthesis of glycosaminoglycans (GAGs) requires the coordinated action of an array of glycosyltransferases (GTs) and sulfotransferases (STs). Although the biosynthetic scheme of HSPGs has been outlined, little is known about the regulation of this complex process. In the first part of our work, we performed structure-function studies of the human ß1,4-galactosyltransferase 7 (ß4GalT7) which catalyses a key step of the initiation of GAG synthesis and identified two conserved domains D163VD165 and 221FWGWGREDDE230 in the ß4GalT family. In vitro studies combined to ex vivo analysis of PG synthesis by 35S incorporation allowed us to determine the impact of site-directed mutations on the catalytic and functional properties of ß4GalT7. We identified key residues for donor UDP-galactose/Mn2+ and acceptor substrate binding, and catalysis. Secondarily, to investigate more in depth the mechanisms involved in the regulation of PG biosynthetic pathway, we inspected the 5 region of the genes coding for GT and ST enzymes and identified the presence of typical CpG islands with the most striking hypermethylation pattern for the 3-OST gene subfamily in the chondrosarcoma cell line H-EMC-SS (HEMC). Aberrant methylation was associated with downregulation of these genes and altered HS-GAG chains, as demonstrated both at biochemical and cellular levels. Treatment of cells with an inhibitor of DNA methyltransferases (5-aza-2 deoxycytidine) or reintroduction of 3-OST cDNA expression into HEMC cells resulted in a decrease in the proliferative and migration capacities of HEMC cells, and augmented adhesion ability of the cells. These findings underline the significance of HS alterations in the invasive phenotype of HEMC and identify 3-O-sulfation as a contributing factor to this process. We show for the first time that a specific set of HS-O-sulfotransferases is regulated via an epigenetic mechanism in HEMC cells, may be of particular relevance in understanding the process of cartilage tumor pathogenesis, towards the development of therapies targeting DNA methylation.NANCY1-Bib. numérique (543959902) / SudocSudocFranceF

Action antagoniste de la glucosamine sur les effets délétères de l'interleukine-1 ou des compressions mécaniques sur la synthèse des protéoglycanes dans des cultures chondrocytaires

NANCY1-SCD Pharmacie-Odontologie (543952101) / SudocPARIS-BIUP (751062107) / SudocSudocFranceF

L'agrécane et le cartilage articulaire : apport des glycosyltransférases dans la réparation du cartilage arthrosique

L'arthrose, la maladie la plus fréquente du système musculo-squelettique, est la conséquence de processus mécaniques et biologiques qui rompent l'homéostasie du cartilage, de la synoviale et de l'os sous-chondral. Dans le but de développer de nouvelles thérapeutiques efficaces, visant à restaurer la matrice cartilagineuse, nous caractérisons les mécanismes moléculaires et les protéines-clés responsables de l'initiation de la maladie. Un des évènements les plus précoces est la dégradation de l'agrécane qui est le protéoglycane matriciel le plus abondant. Les chaînes de chondroïtine sulfate liées à la protéine porteuse sont découpées en petits fragments. Le laboratoire s'intéresse aux glycosyltransférases qui catalysent la formation des chaînes polysaccharidiques, en particulier celles impliquées dans la synthèse de l'amorce tétrasaccharidique commune de liaison à la protéine porteuse, GlcA$\beta$1,3Galβ1,3Gal$\beta$1,4Xyl-O-Sérine. La galactose β1,3-glucuronosyltransférase-I (GlcAT-I), qui attache l'acide glucuronique terminal et qui est fortement réprimée durant l'arthrose, est une cible potentiellement intéressante. En effet, l'enzyme recombinante humaine joue un rôle primordial dans la synthèse des glycosaminoglycanes (GAG). La surexpression de la GlcAT-I dans des explants de cartilage traités par l'IL1$\beta$ est capable de s'opposer complètement à la déplétion en protéoglycanes provoquées par cette cytokine pro-inflammatoire. Des études structure/fonction/régulation de cette enzyme ont alors été entreprises. Les résultats constituent les bases pour le développement de plusieurs thérapeutiques basées sur la vectorisation de gènes en intra-articulaire et la conception de glycomimétiques capables de réparer le cartilage