LentiPro stable producer cells: Delivering scalable and reliable lentiviral vector manufacturing

Lentiviral vectors are one of the most currently used viral vectors for gene and cell therapies. Their use in clinical protocols has significantly increased in the past 5 years with the approval of several gene therapeutic products relying on lentiviral vector gene delivery. Capable of transducing non-dividing cells and presenting safer integration profiles as self-inactivating vectors, lentiviral vectors have progressively undertaken gammaretroviral vector use in gene therapies. However the knowledge on lentiviral vector manufacture is far more immature than that of gammaretroviral vectors. While the production of gammaretrovirus rely on stable producer cell lines and perfusion systems, enabling high cell density and longer term productions, most of the bioprocesses for lentiviral bioproducts rely on transient transfections and short term batch productions. At the upstream process, many of the challenges lentiviral bioproducts present in their manufacturing are related to the apoptosis leading cytotoxicity of some of the vector components. Supported on our long track experience and enabling tools developed for gammaretrovirus manufacturing, we carried out the challenge of establishing a constitutive stable lentiviral producer cell line. To surpass the challenges we proposed to eliminate or reduce the cytotoxicity of the lentiviral vector expression components1. Several strategic novelties were introduced in the development of the cell line namely: (i) the use of a modified gag-pro-pol, (ii) introduction of all the third generation lentiviral expression cassettes by chemical transfection instead of viral transduction and (iii) performing only one clone screening step (enabling the use on the ‘Single step cloning screening’ protocol developed by our group2). After establishing a stable producer cell line the culture conditions were developed with the main aim of extending bioreaction culture time and viral vector total yields. A lentiviral producer cell line constitutively producing infective titers above 106 TU.mL-1.day-1 was established. Moreover the new protocol to generate the cell line enabled its development in less than six months. The cell line showed to be stable, consistently maintaining vector productivity over one month in the absence of antibiotics. At the bioreaction process it was possible to maintain the cells continuously producing over 10 days1. These results validate the transition to continuous or perfusion large-scale production systems qualifying the strengths and advantages of the strategies followed. This work to be presented will discuss the challenges on the manufacture and scale-up of lentiviral vectors as well the strategies and novel technologies to be adopted to enable effective upstream processes. 1Tomás et al. (2018) ‘LentiPro26: novel stable cell lines for constitutive lentiviral vector production\u27 Sci Rep. 8(1):5271 2 Rodrigues et al. (2015) ‘Single step cloning-screening method: a new tool for developing and studying high-titer viral vector producer cells\u27 Gene Ther. 22(9):6

Application of functional genomics in the production of viral biopharmaceuticals: vaccines and vectors for gene therapy

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Celular e Biotecnologia). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2012Retrovirus (RV) based biopharmaceuticals comprise several valuable bioproducts such as gene therapy vectors, recombinant vaccines and replicative-competent particles for oncolytic therapy. However, RV manufacture faces several challenges, particularly the low yields of current producer cell lines and the high content of non-infective particles (an average of 1 in every 100 total viruses produced are infective), contaminating the viral preparations. The identification and manipulation of the metabolic requirements for improved virus production is the scope of this project. In this context, this master thesis proposed to i) validate metabolic pathways recruited under a virus production state – previously identified by transcriptional profiling – by culture medium manipulation and ii) implement a novel method to screen for high-producing clones after gene metabolic engineering. Medium manipulation enabled increased titers from 1.3 to 2.1 fold upon isolated medium supplementation strategies, reaching a synergistic effect with their combination of 6 fold increase. The improvement in RV production was not associated to increased viral genes expression; it was partially due to higher viral vector preparation quality (enhanced half-life for 2-3 hours and higher infectious particles per total particles content) and to an enhanced metabolic status of the producer cell. For the screening method a novel protocol was implemented taking advantage of split proteins technology enabling the isolation of the high-titer clones from the producer population by the assessment of their titers in the first stage of clone isolation - Single Step Cloning-Titration. Validated metabolic pathway will now be object of gene-based metabolic engineering which, resorting to the implemented protocol, can be conducted in a large-scale multi-gene approach, never attempted before. This work directly contributes for improved cell line development in RV manufacture and encompasses pioneering steps in mammalian cell multi-gene metabolic engineering.Os retrovírus (RVs) são vírus com invólucro da família Retroviridae. Caracterizam-se por possuírem um genoma de cadeia simples de RNA positivo (7-11 kb), pela capacidade da sua transcrição reversa de RNA para DNA e por possuírem no seu ciclo de replicação uma etapa obrigatória de integração estável do seu genoma num cromossoma do hospedeiro. No que diz respeito ao seu genoma e composição proteica, os RV possuem várias vantagens que lhes conferem grande sucesso na sua utilização como biofármacos, tais como: (i) genoma bem estudado, passível de ser manipulado por técnicas de biologia molecular, (ii) capacidade de encapsidação de genomas até 9 kb, (iii) elevada eficiência de transdução in vivo e in vitro, (iv) capacidade de modificar permanentemente o conteúdo genético da célula alvo, possibilitando a expressão a longo prazo do gene terapêutico, (v) a sua baixa imunogenicidade em comparação com outros vectores virais, e (vi) a capacidade para incorporar proteínas de envelope de uma ampla variedade de vírus heterólogos, proporcionando um meio de selecionar as células alvo a serem infectadas ou, para a apresentação de antigénios. Os vectores derivados de RV têm sido extensivamente utilizados como ferramentas de transferência de genes em terapia génica; partículas sem genoma demonstraram resultados promissores como candidatos a vacinas recombinantes e, mais recentemente, foram desenvolvidas partículas com competência replicativa para serem utilizadas como agentes oncolíticos para a terapia de vários tipos de cancro. A produção de vectores retrovirais é realizada em células de mamíferos, geralmente com origem de ratinho ou humanas, de forma transiente ou estável. A produção estável para uma produção contínua requer a incorporação sequencial de, pelo menos, três cassetes de expressão independentes (sistema de terceira geração); gag-pol (proteínas virais estruturais e enzimáticas), env (glicoproteínas do envelope) e do transgene, que contém o gene de interesse clonado no esqueleto viral. Cada estágio de inserção requer selecção por antibiótico, clonagem e uma análise extensa dos clones para encontrar aqueles com maior expressão e adequada estequiometria dos componentes virais. Assim, o estabelecimento de uma linha celular produtora demora aproximadamente um ano até estar concluído. Do ponto de vista de produção, os sobrenadantes de vectores retrovirais caracteriza-se por títulos relativamente baixos, cerca de 106 partículas infecciosas por ml de meio de cultura. Considerando que a quantidade média necessária para tratar um paciente num ensaio clínico ronda 1010 particulas infecciosas, seria previsto cerca de 10 a 100 L de volume de cultura para cada paciente. Adicionalmente, as preparações virais são tipicamente caracterizados por razões baixas de partículas infecciosas/partículas totais (cerca de 1:100), o que reduz a eficiência terapêutica dos vectores infecciosos. Assim, os sistemas de produção existentes estão longe de satisfazer as necessidades requeridas para a sua ampla utilização terapêutica ou profilática. A engenharia metabólica surge como uma ferramenta atractiva para melhorar a produtividade celular. Contudo, os incrementos na produtividade em células de mamífero são modestos (cerca de 2 vezes) e, normalmente, baseados em aumentos na produtividade volumétrica em vez de específica (da célula). O metabolismo e as redes metabólicas são redundantes sendo que o mesmo padrão de produção/consumo de um metabolito pode ser originado por diferentes combinações de reacções não conceptualizadas enquanto "via metabólica", no sentido clássico. Assim, manipulações pontuais (um gene) são geralmente absorvidas pela rede e "diluídas" sem efeitos fenotípicos óbvios. Este problema aumenta de dimensão com a complexidade, o elevado grau de regulação e o nível de compartimentação celular das células de mamíferos. Actualmente, realizar engenharia metabólica em células de mamífero é um processo trabalhoso uma vez que envolve a introdução dos genes para as vias alvo e o isolamento e caracterização das centenas de clones isolados. Em suma, a produção de RV enfrenta dois desafios: aumentar a produtividade celular para dar resposta às quantidades requeridas para uso terapêutico necessitando portanto de estratégias rápidas para a análise da produtividade dos clones obtidos. Para responder a este desafio, esta tese de mestrado teve como objetivos (1) validar resultados de transcriptómica que identificaram vias metabólicas relevantes na produção des retrovírus por manipulações específicas do meio de cultura de células 293 FLEX e (2) desenvolver um método de clonagem e titulação com capacidade de análise high-throughput. As manipulações executadas foram direcionadas para vias metabólicas recrutadas em células produtoras de fácil manipulação, ou seja, vias de consumo de unidades básicas: metabolismo de ácidos nucleicos, metabolismo de aminoácidos, destoxificação de radicais livres e metabolismo das poliaminas. O meio de cultura foi suplementado com uma ou mais combinações dos seguintes suplementos: aminoácidos, nucleósidos, antioxidantes, poliaminas e glutationo reduzido. A produtividade viral aumentou em todas as condições utilizadas. Com suplementos únicos o título viral aumentou 1.3 a 1.9 vezes; com a conjugação de dois suplementos - aminoácidos e nucleósidos, antioxidantes com poliaminas ou glutationo reduzido - aumentou 1.5, 2 e 2.1 vezes. No entanto, o maior efeito a nível de produção foi conseguido pelo cocktail de todos os suplementos, atingindo um aumento de 6 vezes. O incremento na produção de RV não foi associado a um aumento da expressão de genes virais; foi parcialmente baseado numa maior qualidade do sobrenadante viral e e num estado metabólico melhorado das células produtoras. Adicionalmente, os suplementos de aminoácidos e cocktail aumentaram a estabilidade das partículas virais em respectivamente mais 3 horas e 2 horas. Estes resultados indicam uma origem metabólica no constrangimento da produtividade viral. Estes resultados demonstraram que a manipulação orquestrada de vias independentes conduz a efeitos sinergísticos de aumento de título evidenciando a necessidade de uma manipulação concertada das vias metabólicas para obter efeitos de maior impacto. Do ponto de vista do bioprocesso, a adição de suplementos no meio de cultura para produção de biofármacos não é interessante uma vez que requere a utilização de sistemas fed-batch aumentanto os custos de produção. Assim, é necessário tornar a célula produtora mais robusta e independente de estímulos externos para atingir um estado de elevada produtividade. A engenharia metabólica de múltiplas vias (genes) surge então como uma ferramenta potencial para atingir um estado celular de híper-produtividade. Contudo, não só o estabelecimento de uma linha celular produtora é um processo demorado; as mesmas limitações surgem para populações de células produtoras alvo de engenharia metabólica. Fenótipos híper-produtores são eventos raros, mesmo quando a manipulação se revela benéfica, uma vez que dependem de níveis de expressão altamente regulada dos genes alvo, dependendo do número de cópias inseridas, assim como o seu local de integração cromossómica. O problema cresce exponencialmente para múltiplas manipulações génicas. Para responder a esta necessidade, o segundo objectivo desta tese consistiu no desenvolvimento de um método rápido e eficiente para a clonagem e simultânea titulação de células produtoras, acoplado a um potencial de análise high-throughput. O protocolo implementado usa a recente tecnologia da proteína verde separada (split GFP) que consiste na proteína GFP dividida em dois fragmentos (GFP S10 e GFP S11) e é implementado em placas de 96 poços. As células produtoras expressam mCherry e produzem vírus com um transgene que codifica para uma proteína de fusão LacZ-S11. Estas células são plaqueadas a 1 célula por poço (clonagem) e ao sexto dia de cultura, as células alvo, expressando constutivamente a proteína complementar GFP S10, são adicionadas. Durante o restante tempo de cultura é propiciada a infecção das células alvo pela adição de polibereno. Por infecção a proteína GFP S10 da células alvo vai sendo transcomplementada com o fragmento GFP S11 originando sinal de fluorescência directamente proporcional ao número de vírus produzidos. Após 14 dias de cultura as placas de cultura são analisadas num fluorimetro e os poços com maior razão GFP/mCherry são isolados, assegurando assim que os clones seleccionados são os melhores produtores. Os clones podem ser isolados das células alvo por qualquer marca de resistência a antibiótico expressa pelos componentes virais (Zeocina, Blasticidina e Neomicina) e/ou através de puromicina (parte da construção mCherry). A linha celular alvo foi estabelecida com as células Te671 por infecção com lentivirus que entregaram o gene da GFP S10. A linha celular produtora foi criada a partir das células 293 FLEX e 293 CEB 22; a primeira produz vectores retrovirais recombinantes baseados no vírus da leucemia murina (Murine Leukemia Virus, MLV), pseudotipados com a proteína do invólucro do vírus da leucemia do macaco gibão (Gibbon Ape Leukemia Virus, GaLV) e contendo um transgene codificante para a enzima β-galactosidase (gene LacZ); a segunda é a linha celular percussora das 293 FLEX anterior à inserção da cassete génica para a expressão do invólucro. A tecnologia de troca de cassete mediada pela recombinase (RMCE) permitiu trocar o transgene LacZ-S11 com o anterior até então expresso (LacZ). O clone 32 das células 293 CEB 22 S11 foi utilizado para validar o protocolo após ser submetido a duas etapas de transfecção; a primeira para inserir o marcador celular mCherry e a segunda para introduzir o envelope GaLV. A população obtida foi então sujeita ao protocolo de clonagem e titulação permitindo o isolamento de clones de elevadas produtividades pela quantificação dos seus títulos na primeira etapa de isolamento do clone. Nenhum dos clones 293 FLEX S11 isolados produzia vírus à mesma escala que as células parentais, provavelmente devido a uma baixa eficiência de troca de cassete nestas células; o protocolo estabelecido foi então usado para isolar clones 293 FLEX S11 nesta população, permitindo isolar um clone produtor. Assim, o protocolo de clonagem e titulação desenvolvido proporciona uma ferramenta útil para ultrapassar as limitações impostas pela análise exaustiva de clones por métodos manuais, maximizando a probabilidade de identificar clones com fenótipo híper-produtor. As vias metabólicas identificadas por dados de transcriptómica e validadas neste trabalho serão alvo de engenharia metabólica por manipulação combinada de múltiplos genes, apenas possível devido à implementação do protocolo de clonagem e titulação durante a presente tes