Correlation between Agar Plate Screening and Solid-State Fermentation for the Prediction of Cellulase Production by Trichoderma Strains

The viability of converting biomass into biofuels and chemicals still requires further development towards the reduction of the enzyme production costs. Thus, there is a growing demand for the development of efficient procedures for selection of cellulaseproducing microorganisms. This work correlates qualitative screening using agar plate assays with quantitative measurements of cellulase production during cultivation under solid-state fermentation (SSF). The initial screening step consisted of observation of the growth of 78 preselected strains of the genus Trichoderma on plates, using microcrystalline cellulose as carbon source. The 49 strains that were able to grow on this substrate were then subjected to a second screening step using the Congo red test. From this test it was possible to select 10 strains that presented the highest enzymatic indices (EI), with values ranging from 1.51 to 1.90. SSF cultivations using sugarcane bagasse and wheat bran as substrates were performed using selected strains. The CG 104NH strain presented the highest EGase activity (25.93 UI·g −1 ). The EI results obtained in the screening procedure using plates were compared with cellulase production under SSF. A correlation coefficient (R 2 ) of 0.977 was obtained between the Congo red test and SSF, demonstrating that the two methodologies were in good agreement

Phenology of herbaceous species in cerrado: comparisons between intact, burnt, and reforested areas

Vegetative and reproductive phenology was described for a sample of herbaceous species at sites covered by intact and disturbed cerrado in Southeastern Brazil. Herbaceous species showed three flowering strategies – continual, episodic and seasonal – as well as three fruiting strategies – continual, lengthy and seasonal. The phenological patterns were largely influenced by meteorological variables, but some differences between intact, reforested and burnt sites were recorded. Recent studies pointed out the major importance of the herbaceous component in cerrado community studies as well as the lack of substantial data on this stratum that could lead to generalizations. The present study pointed out the existence of some phenological differences of herbs growing in disturbed and undisturbed cerrado, and the need of carrying out comparative studies to verify if these differences are due to the site conditions or the species composition.La fenologia vegetativa y reproductiva fue descrita para una muestra de especies herbáceas en los sitios cubiertos con cerrado intacto y disturbó en sudeste de Brasil. Las especies herbáceas demostraron tres estrategias florecientes - continuas, episódicas y estacionales - así como tres estrategias fructíferas - continuas, muy largas y estacionales. Los patrones fenológicos fueron influenciados en gran parte por variables meteorológicas, pero algunas diferencias en los intacto, reforestado y quemado sitios fueron registradas. Los estudios recientes precisaron la mayor importancia del componente herbáceo en estudios de la comunidad del cerrado tan bien como la carencia de datos substanciales sobre este estrato que podría llevar a las generalizaciones. El actual estudio precisó la existencia de algunas diferencias fenológicas de las hierbas que crecían en cerrado disturbado e imperturbado, y la necesidad de realizar estudios comparativos para verificar si estas diferencias son debido a las condiciones del sitio o a la composición de especies.A fenologia vegetativa e reprodutiva foi descrita para uma amostra de espécies herbáceas em áreas cobertas por savana (cerrado) intacto e alterado no sudeste do Brasil. As espécies herbáceas mostraram três estratégias de floração - contínua, episódica e sazonal – bem como três estratégias de frutificação – contínua, longa e sazonal. Os padrões fenológicos foram grandemente influenciados por variáveis meteorológicas, evidenciando diferenças entre as áreas cobertas por cerrado intacto, reflorestado e queimado. Estudos recentes têm mostrado a grande importância do componente herbáceo em estudos de comunidades do cerrado, assim como a falta de dados substanciais sobre este estrato que possam gerar generalizações. O presente estudo mostrou a existência de algumas diferenças fenológicas entre as herbáceas de cerrado, crescendo em áreas alteradas e intactas, e a necessidade da realização de estudos comparativos para verificar se tais diferenças são devido às condições das áreas ou da composição de espécies

Secretome Data from Trichoderma Reesei and Aspergillus Niger Cultivated in Submerged and Sequential Fermentation Methods

The cultivation procedure and the fungal strain applied for enzyme production may influence levels and profile of the proteins produced. The proteomic analysis data presented here provide critical informa- tion to compare proteins secreted by Trichoderma reesei and Aspergillus niger when cultivated through submerged and sequential fermenta- tion processes, using steam-explosion sugarcane bagasse as inducer for enzyme production. The proteins were organized according to the families described in CAZy database as cellulases, hemicellulases, proteases/peptidases, cell-wall-protein, lipases, others (catalase, ester- ase, etc.), glycoside hydrolases families, predicted and hypothetical proteins. Further detailed analysis of this data is provided in “Secre- tome analysis of Trichoderma reesei and Aspergillus niger cultivated by submerged and sequential fermentation process: enzyme production for sugarcane bagasse hydrolysis” C. Florencio, F.M. Cunha, A.C Badino, C.S. Farinas, E. Ximenes, M.R. Ladisch (2016) [1]

Composition and phenology of herbaceous species in heterogeneous reforestation

Heterogeneous reforestations are constituted mainly by plant species with easy germination, fast growing, and which follows the Resolução SMA 8/07. Due to the scarcity of information about the herbaceous component in heterogeneous reforestations, the present study aimed to verify the presence of cerrado (savannah) herbaceous species in a heterogeneous reforestation in São Carlos, São Paulo State, twenty five species belonging to seven families were found, in the heterogeneous reforestation whereas in the cerrado, 35 herbaceous species belonging to nine families were registered. Seventeen cerrado species were also found at the reforestation area. Cerrado species flowering was positively correlated to the average temperature and to pluvial precipitation. In reforestation, flowering was not correlated to climatic variables. In conclusion, the heterogeneous reforestation area sheltered the major number of cerrado herbaceous species, but long-term studies are still needed to a better comprehension of the flowering dynamics of herbaceous plants in heterogeneous reforestation areas.Os reflorestamentos heterogêneos normalmente são feitos utilizando-se espécies vegetais de fácil germinação, rápido crescimento e que atendam à Resolução SMA 8/07. Tendo em vista serem escassas as informações sobre o componente herbáceo em reflorestamentos heterogêneos, o presente estudo teve por objetivo verificar a presença de plantas herbáceas de cerrado em um reflorestamento heterogêneo em São Carlos, estado de São Paulo. Foram levantadas as espécies herbáceas presentes em transectos estabelecidos em área de reflorestamento heterogêneo e em área próxima de cerrado stricto sensu. No reflorestamento heterogêneo foram registradas 25 espécies, pertencentes a sete famílias, e no cerrado foram registradas 35 espécies herbáceas, pertencentes a nove famílias. Dezessete espécies do cerrado também foram encontradas no reflorestamento. A floração das espécies de cerrado correlacionou-se positivamente com a temperatura média e a precipitação pluvial. No reflorestamento heterogêneo não foi encontrada correlação entre floração e variáveis meteorológicas. Conclui-se que a área de reflorestamento heterogêneo abriga grande parte da flora herbácea existente no cerrado da região, porém investigações de longo prazo ainda são necessárias para a compreensão adequada da dinâmica das plantas herbáceas em áreas de reflorestamento heterogêneo

Microrganismos produtores de celulases: seleção de isolados de Trichoderma spp

The search for microorganism that produces cellulolytic enzymes is of the great importance in contributing to the viability of biological route for the production of cellulosic ethanol. Among filamentous fungi, the genus Trichoderma is characterized as a high enzyme producer. Given the growing demand for the development of processes that reduce the cost of cellulases had been proposed this work which aims to evaluate and select strains of filamentous fungi Trichoderma, available at Embrapa banks, capable of producing high concentrations of complex cellulolytic enzymes. The methodology developed in the project was divided in four steps until the final selection of the best strains. The first step of evaluation consisted in the observation of the growth of 78 pre-selected strains of Trichoderma from the degradation of microcrystalline cellulose, Avicel. The second step of selection, Congo red test, summarized in the determination of halo hydrolysis and the measurement of enzymatic index (diameter of halo hydrolysis. diameter halo colony-1) of each strain. The third stage was evaluated the strains with greater potential to produce cellulases in fermentation test tubes for the enzymes CMCase, Xylanase e FPAse. The last stage of evaluate and select of strains was solid-state fermentation (SSF). In the first step of selection, 49 strains showed the ability to metabolize the substrate microcrystalline cellulose, Avicel. The Congo red test, the second step, selected the ten best strains obtained with enzymatic indexes above 1.50, ranging from 1.51 to 1.90. In the process of fermentation in tubes were selected three strains with the better production of enzymes among the ten selected on Congo red test, T. harzianum CEN 139, T. harzianum CEN 155 and T. sp CG 104NH. For evaluation the enzymatic production in SSF was held initially a factorial experimental design to select the significant variables in the process. The variables studied were: inoculum concentration, moisture and proportion of sugarcane bagasse. After the CMCAse enzyme analysis was observed the proportion of sugarcane bagasse as a significant variable. From this result it was performed a central composite design for the improvement of fermentative parameters: the proportion of bagasse and moisture. The proportion of bagasse was significant and enzyme activity reached 11.16 UI.g-1 to CMCase. The process of SSF, among three tested strains, selected T. sp CG 104NH as the best producer of CMCase, Xylanase and FPase, with values of 25.93 UI.g-1, 67.17 UI.g-1 and 1.87 UI.g -1, respectively. The correlation coefficient between this process (SSF) and Congo red test was R2 = 0.97, 0.98 and 0.97 for the three enzymes studied, CMCase, Xylanase and FPase respectively. Therefore, it was possible to obtain a linear correlation between these two methodologies. The selection steps evaluated in this study were considered effective, quality selections proved quick selection of an extensive database of fungi. The linear correlation between the tests made with red Congo and SSF indicate that is possible to use the combination of qualitative and quantitative methods to assess the ability of cellulase production by filamentous fungi.Universidade Federal de Minas GeraisA busca por microrganismos produtores de enzimas celulolíticas é uma etapa de suma importância para contribuir com a viabilização da rota biológica de produção de etanol lignocelulósico. Dentre os fungos filamentosos, os do gênero Trichoderma se destacam pela alta produção enzimática exibida. Dada a crescente demanda pelo desenvolvimento de processos que reduzam os custos das celulases, foi proposto o presente trabalho que tem como objetivo avaliar e selecionar isolados de fungos filamentosos Trichoderma, disponíveis nos bancos da Embrapa, capazes de produzir altas concentrações de enzimas do complexo celulolítico. A metodologia desenvolvida no projeto foi dividida em quatro etapas até a seleção final das melhores linhagens. A primeira etapa de avaliação consistiu na observação do crescimento das 78 linhagens isoladas de Trichoderma, a partir da degradação do substrato microcelulósico cristalino, Avicel. A segunda etapa de seleção, o teste do vermelho congo, resumiu-se na determinação do halo de hidrólise e na medida do índice enzimático (diâmetro halo hidrólise. diâmetro halo colônia-1) de cada linhagem. Na terceira etapa foram avaliadas as linhagens com maior potencial produtor de celulases na fermentação em tubos de ensaio, para as enzimas CMCase, Xilanase e FPase. A última etapa de avaliação e seleção das linhagens foi o processo de fermentação em estado sólido (FES). Na primeira etapa de seleção, 49 linhagens apresentaram capacidade de metabolizar o substrato celulósico cristalino, Avicel. O teste do vermelho congo, segunda etapa, selecionou as dez melhores linhagens com índices enzimáticos obtidos acima de 1,50, que variaram de 1,51 a 1,90. No processo de fermentação em tubos de ensaio foram selecionadas três linhagens com a melhor produção de enzimas entre as dez selecionadas no teste do vermelho Congo, T. harzianum CEN 139, T. harzianum CEN 155 e T. sp CG 104NH. Para avaliação da produção enzimática em FES realizou-se inicialmente um planejamento experimental fatorial para selecionar as variáveis significativas no processo. As variáveis estudadas foram: concentração do inóculo, umidade e proporção de bagaço de cana (BC). Após a análise enzimática de CMCase observou-se apenas a proporção de BC como variável significativa. A partir deste resultado, foi realizado um delineamento composto central rotacional com os parâmetros fermentativos: proporção de BC e umidade. A proporção de BC foi significativa e a atividade enzimática alcançou 11,16 UI.g-1 de CMCase. O processo de FES, dentre três linhagens avaliadas, selecionou T. sp CG 104NH como a melhor produtora de CMCase, Xilanase e FPase, com valores de 25,93 UI.g-1, 67,17 UI.g-1 e 1,87 UI.g-1, respectivamente. O coeficiente de correlação entre este processo (FES) e o teste vermelho Congo foi R2 =0,97, 0,98 e 0,97 para as três enzimas estudadas, CMCase, Xilanase e FPase, respectivamente. Obtendo uma correlação linear entre estas duas metodologias. As etapas de seleção avaliadas neste trabalho foram consideradas efetivas, as seleções qualitativas se mostraram rápidas para seleção de um extenso banco de fungos. A correlação direta apresentada entre os ensaios com vermelho Congo e FES indicam que é possível a utilização da combinação entre métodos qualitativos e quantitativos para a avaliação da capacidade de produção de celulases por fungos filamentosos

DESAFIOS RELACIONADOS À PRODUÇÃO E APLICAÇÃO DAS ENZIMAS CELULOLÍTICAS NA HIDRÓLISE DA BIOMASSA LIGNOCELULÓSICA

The second generation (2G) ethanol obtained from lignocellulosic biomass has been considered as a potential alternative source of energy for the transportation sector. However, the technologies to convert lignocellulose into fermentable sugars still face several challenges. One of the major challenges of this process is related to the cost of the cellulolytic enzymes. Thus, the development of bioprocesses for enzyme production and strategies to increase the final yield of the enzymatic hydrolysis reactions are required to ensure the economic feasibility of the biomass conversion process. In this review, it is discussed the progress related to fungal enzyme technology over the past few years with major emphasis on the biocatalysts needed for cellulose degradation as well as on cultivation strategies for the production of enzymes on-site. The potential of applying secretome analysis as a tool for the characterization of the enzymatic complexes and some limitations on the use of enzymatic cocktails in the saccharification step, such as the unproductive adsorption of enzymes onto lignin are also discussed in light of the recent literature