Monitoramento dos herpesvírus EBV, HCMV e HHV-6 em receptores de transplante renal e desenvolvimento de um método de diagnóstico molecular para triagem e diferenciação dos poliomavírus BK e JC

O aumento do risco de infecções oportunistas após o transplante renal requer o monitoramento de infecções virais para se evitar as complicações ocasionadas por esses agentes. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi monitorar a infecção pelos herpesvírus Epstein-Barr (EBV), Citomegalovírus Humano (HCMV) e Herpesvírus Humano tipo 6 (HHV-6) em receptores de transplante renal, correlacionando esses achados com dados sociodemográficos e clínicos dos pacientes no primeiro ano pós-transplante. Além disso, foi realizado o desenvolvimento e implementação de uma técnica de diagnóstico molecular por duplex semi-nested PCR (duplex sn-PCR) para triagem e diferenciação de dois poliomavírus, BKPyV e JCPyV, também importantes no cenário do transplante. Amostras de sangue total, plasma e urina de 82 receptores de transplante renal foram coletadas mensalmente durante o primeiro semestre e trimestralmente no segundo semestre até o período de um ano póstransplante. EBV, HCMV e HHV-6 foram detectados e quantificados por PCR em tempo real, pelo método TaqMan®. Para avaliação da técnica desenvolvida, foram obtidas um total de 87 amostras clínicas a partir dos 82 receptores de transplante renal, sendo 60 amostras de sangue total, 21 amostras de urina, cinco amostras de plasma e uma amostra de biópsia renal. A viremia do EBV e HCMV foi detectada em 32 pacientes (39% cada), enquanto a viremia do HHV-6 em apenas três pacientes (3,7%). O EBV foi significativamente associado com idade (p=0,050), terapia de indução com timoglobulina (p=0,019), terapia baseada em inibidores de mTOR (p=0,003) e sexo feminino (p=0,044). O HCMV foi significativamente associado à indução com basiliximabe (p=0,015), terapia baseada em micofenolato de mofetil (MMF) (p=0,003) e rejeição aguda do aloenxerto (p=0,033). Além disso, a doença por HCMV foi correlacionada com terapia baseada em MMF (p=0,021) e sexo feminino (p=0,003). Quanto ao desenvolvimento da técnica para triagem e diferenciação dos poliomavírus BK e JC por duplex sn-PCR, o limite de detecção de ambos os vírus pela metodologia desenvolvida foi de 10 cópias/μL, sendo a técnica específica para co-detectar os vírus na mesma amostra clínica. Das 87 amostras analisadas, 35,6% (31/87) foram positivas para BKPyV, sendo 11 amostras de urina, 19 amostras de sangue total e uma amostra de biópsia renal, enquanto 3,4% (3/87) foram positivas para JCPyV, sendo as três amostras de urina. As análises mostraram que as viremias do EBV e HCMV foram significativamente associadas com as terapias de imunossupressão de indução e manutenção utilizadas. Além disso, viremia do HCMV clinicamente relevante (>10.000 cópias/mL) foi relacionada à rejeição aguda do aloenxerto, o que reforça a importância do monitoramento viral durante o pós-transplante. Este estudo demonstrou também que a técnica desenvolvida é sensível e específica para detectar e diferenciar BKPyV e JCPyV em diferentes amostras clínicas.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível SuperiorThe increased risk of opportunistic infections after kidney transplant requires monitoring of viral infections to avoid the complications caused by these agents. Thus, the objective of this study was to monitor Epstein-Barr virus (EBV), Human cytomegalovirus (HCMV) and Human herpesvirus type 6 (HHV-6) infection in renal transplant recipients, correlating these findings with sociodemographic and clinical data of the patients during the first year posttransplant. In addition, the development and implementation of a duplex semi-nested PCR (duplex sn-PCR) molecular diagnostic technique for screening and differentiation of two polyomaviruses, BKPyV and JCPyV, also important in the transplant scenario, was performed. Whole blood, plasma and urine samples from 82 renal transplant recipients were collected monthly during the first semester and then quarterly up to one year after transplantation. EBV, HCMV and HHV-6 were detected and quantified by TaqMan real time PCR. For evaluation of the developed technique, a total of 87 clinical samples were obtained from 82 renal transplant recipientes, of which 60 whole blood samples, 21 urine samples, five plasma samples and one renal biopsy sample. EBV and HCMV viremia was detected in 32 patients (39% each), while HHV-6 viremia in only three patients (3.7%). EBV was significantly associated with age (p=0.050), thymoglobuline induction (p=0.019), mTOR inhibitor-based therapy (p=0.003) and female gender (p=0.044). HCMV was significantly associated with basiliximab induction (p=0.015), mycophenolate mofetil (MMF)-based therapy (p=0.003) and allograft acute rejection (p=0.033). Moreover, HCMV-disease was correlated with MMF-based therapy (p=0.021) and female gender (p=0.003). Regarding the development of the technique for screening and differentiation of BKPyV and JCPyV by duplex sn-PCR, the limit of detection for both viruses by the developed technique was 10 copies/μL, of which the specific technique to co-detect both viruses in the same clinical sample. Of the 87 samples analyzed, 35.6% (31/87) were positive for BKPyV, of which 11 urine samples, 19 whole blood samples and one renal biopsy specimen, while 3.4% (3/87) were positive for JCPyV, all of them were urine samples. The analyzes showed that EBV and HCMV viremia were significantly associated with different immunosuppresive induction and maintenance strategies. In addition, clinically relevant HCMV viremia (>10.000 copies/mL) was related to acute allograft rejection, which reinforces the importance of viral monitoring during post-transplantation. This study also showed that the developed technique is sensitive and specific to detect and differentiate BKPyV and JCPyV in different clinical samples.130f