Nuevas funciones de las proteínas Fur en cianobacterias: Contribución a la definición del regulón FurA en Anabaena sp. PCC 7120

En el presente trabajo de tesis nos propusimos avanzar en el conocimiento de la funciones de las proteínas Fur en cianobacterias mediante el estudio del regulón FurA de la cianobacteria filamentosa formadora de heterocistos Anabaena sp. PCC 7120. Como herramienta de trabajo para el estudio del regulón construimos una estirpe de sobreexpresión de FurA en Anabaena sp. PCC 7120, empleando un vector lanzadera con orígenes de replicación en E. coli y Anabaena sp. que logró incrementar hasta ~32 veces el nivel de expresión del metalorregulador. Una vez obtenida la estirpe de sobreexpresión, denominada Anabaena sp. AG2770FurA, se procedió a realizar un análisis fenotípico de la nueva cepa con el objetivo de identificar los posibles cambios morfológicos, fisiológicos y moleculares acontecidos en el microorganismo como consecuencia directa o indirecta de la sobreexpresión del regulador transcripcional. El análisis fenotípico incluyó la evaluación comparativa de la velocidad de crecimiento y el tiempo de duplicación en medio BG11, la concentración de pigmentos fotosintéticos (clorofila a, carotenoides, ficobiliproteínas) y proteínas totales en diferentes fases del crecimiento, así como el estudio por microscopía óptica y electrónica de la morfología celular, la integridad de los filamentos, la autofluorescencia y la ultraestructura de las células. Se evaluó asimismo la actividad fotosintética según la evolución de oxígeno mediante electrodo de Clark y se compararon además actividades enzimáticas tales como catalasa y superóxido-dismutasa, la producción de especies reactivas del oxígeno y la tolerancia a estrés oxidativo tras la exposición a una fuente exógena de peróxido de hidrógeno. Como parte del estudio fenotípico se realizó además un análisis proteómico comparativo entre la estirpe de sobreexpresión y la cepa isogénica parental crecidas bajos las mismas condiciones de cultivo. Sobre la base de los cambios fenotípicos observados se investigó el impacto de la sobreexpresión de FurA sobre la transcripción de una variedad de genes de interés mediante sqRT-PCR. Posteriormente, con el fin de identificar los cambios en la expresión génica directamente mediados por FurA, se analizó mediante retardo en gel (EMSA) la afinidad in vitro de FurA recombinante a cada uno de los promotores de los genes evaluados previamente por sqRT-PCR. La sobreexpresión del metalorregulador en Anabaena sp. indujo múltiples cambios fenotípicos en la cianobacteria como consecuencia de la variación en la expresión de una variedad de genes de categorías funcionales diversas, tanto dianas transcripcionales directas como otros genes. La combinación de estudios fenotípicos, análisis comparativos de la expresión génica y ensayos de afinidad in vitro FurA-DNA condujeron a la identificación inicial de al menos 13 nuevas dianas transcripcionales directas, implicadas en procesos celulares tales como el metabolismo del hierro, las defensas frente el daño oxidativo, la fotosíntesis, la diferenciación a heterocistos, el metabolismo energético, la morfología celular y la replicación del DNA, entre otras. Los resultados demostraban el papel de FurA como regulador global de la transcripción en cianobacterias, de forma similar a lo observado con proteínas Fur de bacterias heterotróficas. Con el objetivo de profundizar en la función de FurA como regulador de la homeostasis del hierro, realizamos adicionalmente un estudio comparativo de la expresión génica de la estirpe de sobreexpresión en condiciones de suficiencia y deficiencia de hierro, prestando especial interés en varios mediadores del metabolismo de este micronutriente esencial en Anabaena sp. PCC 7120. Los resultados obtenidos demostraron el papel de FurA como regulador máster de la homeostasis del hierro en Anabaena sp., modulando la expresión de genes implicados en prácticamente cada etapa del metabolismo del hierro, incluyendo la adquisición, transporte, almacenamiento y consumo del hierro en la célula. Los resultados asociados a este experimento permitieron identificar por primera vez al regulador FurA como un modulador transcripcional dual (represor y activador) en la ruta de biosíntesis de tetrapirroles. La acción activadora de FurA sobre la transcripción de los genes hemK (protoporfirinógeno-oxidasa) y hemH (ferroquelatasa) constituye el primer ejemplo documentado de activación transcripcional directa de una proteína Fur en cianobacterias. La participación de FurA como modulador transcripcional en otros procesos celulares típicos de cianobacterias como la diferenciación celular a heterocistos constituyó un objetivo de especial interés en nuestra investigación. La sobreexpresión del metalorregulador bajo condiciones de deficiencia de nitrógeno combinado en el medio de cultivo condujo al bloqueo parcial del proceso de diferenciación a heterocistos en estadios tempranos del desarrollo. Estudios de afinidad in vitro mediante EMSA y footprinting demostraron que FurA reconoce y se une específicamente al promotor de ntcA, cuyo producto génico actúa como regulador transcripcional global del metabolismo del nitrógeno. La sobreexpresión de FurA afectó sensiblemente el incremento transitorio de NtcA que tiene lugar en las primeras horas del desarrollo del heterocisto y que resulta esencial para la ulterior expresión de una variedad de genes implicados en la cascada regulatoria que define al proceso de diferenciación. Los resultados de nuestras investigaciones y de trabajos previos de nuestro grupo sugieren que la expresión de FurA en el heterocisto está ligada al desarrollo del mismo, es regulada por NtcA y su abundancia en cada momento influye directamente en el normal proceso de diferenciación. FurA parece funcionar como un modulador de la expresión de ntcA, que regula adecuadamente los niveles de NtcA en las diferentes fases de desarrollo del heterocisto y constituye un punto clave de conexión entre la homeostasis del hierro y el metabolismo del nitrógeno en cianobacterias. Con la identificación de un gran número de nuevas dianas directas de FurA durante el transcurso de esta tesis fue posible además, mediante análisis in silico de varias secuencias protegidas por FurA en ensayos de footprinting, la definición de una posible secuencia regulatoria consenso de 23 pb (TGATAAAAATTCTCAATAAATAA), que gobierna potencialmente la unión del metalorregulador a sus promotores diana. En esta secuencia consenso fueron reconocidos al menos tres motivos de unión a proteínas Fur de 8 pb en disposición ¿head-to-head-to-tail¿. De modo general, los resultados del presente trabajo de tesis en su conjunto demuestran el papel de FurA como regulador global de la transcripción en cianobacterias, controlando mediante diferentes mecanismos de regulación no sólo la expresión de los genes implicados en el metabolismo del hierro, sino además la de una variedad de genes y operones implicados en múltiples funciones celulares, algunas de las cuales no descritas con anterioridad en bacterias heterotróficas. Los resultados obtenidos constituyen un importante aporte al conocimiento del papel de las proteínas Fur en la fisiología de las cianobacterias

Rol de FurC en Anabaena sp. PCC 7120

La proteína FurC es una de las tres proteínas de la familia Fur (Ferric Uptake Regulator) que posee Anabaena sp. PCC 7120. Esta familia de proteínas es la encargada de regular la homeostasis del hierro, aunque también se ha visto que son capaces de realizar otras funciones. En concreto FurA modula la respuesta de la cinaobacteria al estrés oxidativo y FurB se une inespecíficamente al DNA para protegerlo del daño oxidativo. Sin embargo, FurC es la menos conocida y por ello este trabajo consiste en realizar un estudio de su papel. Para la realización de este trabajo se ha obtenido un mutante de Anabaena sp. 7120 que sobreexpresa FurC (EB2770FurC). También se ha analizado la transcripción de furC en un cultivo de Anabaena WT a distintos tiempos después de retirar el nitrógeno del medio. Y se ha realizado un ensayo de pull-down para determinar a qué proteínas se une FurC. Los resultados fueron que la transcripción de furC se activa en déficit de nitrógeno y que FurC se une a dos proteínas linker que forman parte de los ficobilisomas de Anabaena. Por otro lado, los estudios con el mutante de sobreexpresión de FurC revelaron que EB2770C posee un mayor ratio de ficobiliproteínas/proteínas totales en presencia o ausencia de nitrógeno en el medio de cultivo. Con estos resultados se ha propuesto un modelo de acción de FurC. Este modelo propone que un déficit de ficobiliproteínas aumenta la expresión de FurC, que actúa uniéndose a los ficobilisomas y estabilizándolos

Obtención y caracterización de proteínas Fur de microorganismos de interés biotecnológico y sanitario

Fur (Ferric uptake regulator) es un regulador global responsable de mantener la homeostasis del hierro en la mayor parte de procariotas. En muchos patógenos, Fur es esencial para la expresión de factores de virulencia y la colonización de los tejidos infectados, por lo que Fur se considera una prometedora futura diana en la búsqueda de nuevos fármacos. En este trabajo se ha llevado a cabo el clonaje de las proteínas Fur de Legionella pneumophila y Staphylococcus aureus en un vector de expresión, se han sobreexpresado en Escherichia coli y se ha llevado a cabo una purificación y una primera caracterización de la proteína Fur de S. aureus, consistente en conocer algunas características básicas de la proteína, así como comprobar que ha mantenido su actividad. Se han elegido estos dos microorganismos ya que ambos son importantes patógenos humanos y pertenecen a grupos distintos, puesto que L. pneumophila se trata de una bacteria Gram negativa, mientras que S. aureus es Gram positiva. Esta primera caracterización tiene como objetivo conseguir toda la información posible que permitirá diseñar una estrategia de búsqueda de potenciales inhibidores mediante cribado de una quimioteca. Por tanto este trabajo se enmarca dentro de un proyecto más amplio de búsqueda de potenciales antimicrobianos basados en la inhibición de la proteína Fur en diferentes microorganismos patógenos

Purificación y estudio de dos nuevos reguladores transcripcionales de la cianobacteria Anabaena sp. PCC7120

Las cianobacterias son microorganismos procariotas fotosintéticos con una enorme importancia ecológica, pues gracias a su capacidad fotosintética son responsables de la fijación de carbono inorgánico y uno de los principales productores primarios de oxígeno. Además, algunas especies son capaces de fijar nitrógeno atmosférico en células especializadas que reciben el nombre de heterocistos, gracias a lo cual pueden ser utilizadas como biofertilizantes o en la producción de biocombustibles. Por tanto, comprender la regulación de estos procesos es de gran interés, no solo para ampliar el conocimiento sobre la fisiología de las cianobacterias, sino también para implementar, optimizar y mejorar sus aplicaciones biotecnológicas.Tanto la fotosíntesis como la fijación de nitrógeno tienen un alto requerimiento de metales, lo que hace el control de la homeostasis de metales sea un proceso crucial en cianobacterias, pues pese a ser esenciales su exceso genera estrés oxidativo. En procariotas este proceso está controlado por la familia de reguladores FUR (Ferric Uptake Regulator), que en la cianobacteria Anabaena se compone de tres parálogos: FurA, FurB y FurC. No obstante, las proteínas FUR en Anabaena no solo controlan la homeostasis de metales, sino que son reguladores globales que controlan muchos otros procesos, como los mecanismos de defensa al estrés oxidativo o el metabolismo del nitrógeno. Además de regular estos procesos de forma directa, se ha propuesto que pueden modular muchos otros genes de forma indirecta, orquestando una red de regulación transcripcional.En este trabajo se han estudiado y purificado las proteínas Alr1976 y All0345, anotadas como posibles reguladores transcripcionales y cuya función es desconocida hasta el momento. Estas proteínas pertenecen a la red de regulación mediada por FurC, implicada en la modulación de la defensa a estrés oxidativo y el metabolismo nitrogenado. Mediante estudios bioinformáticos, se ha podido determinar la familia de reguladores a la que pertenecen, modelar su estructura y conocer sus relaciones filogenéticas. Además, se ha conseguido optimizar un protocolo de purificación para ambas proteínas y determinar sus condiciones de interacción con el DNA. Finalmente, dado que existían indicios que relacionaban estas proteínas con el metabolismo del nitrógeno, se estudió mediante ensayos de retardo en gel su interacción con promotores de genes implicados en este proceso.Los resultados obtenidos muestran que los reguladores Alr1976 y All0345 se unen a regiones promotoras de genes con importantes papeles en el control del metabolismo del nitrógeno y la diferenciación de heterocistos, revelando que estos reguladores son nuevos componentes de la compleja red de regulación que controla estos procesos en cianobacterias.<br /

Identificación de genes implicados en la síntesis de biofilms en Anabaena sp. PCC7120 y análisis de su modulación por la familia de proteínas FUR (ferric uptake regulator)

Las cianobacterias son microorganismos fotosintéticos surgidos hace 3.500 millones de años y que, como otras bacterias, pueden crecer formando biofilms, agregados microbianos en los que viven rodeadas de una matriz de sustancias poliméricas extracelulares. Estos biofilms cianobacterianos son interesantes por sus aplicaciones en el tratamiento de aguas residuales, la biorremediación o la producción de biocombustibles.Aunque los mecanismos reguladores de la formación de biofilms en bacterias heterótrofas han sido caracterizados, en el caso de las cianobacterias el conocimiento es todavía limitado. Las cianobacterias presentan una familia de reguladores transcripcionales, las proteínas FUR (ferric uptake regulator), implicados en la respuesta a estreses abióticos. Controlan principalmente la homeostasis de metales como el hierro y el zinc, aunque también otros procesos como la respuesta frente a estrés oxidativo o la deficiencia de nitrógeno. Dado que los biofilms se sintetizan en respuesta a condiciones de estrés, se ha estudiado la modulación de su formación en la cianobacteria Anabaena sp. PCC7120 por parte de las proteínas FUR.La realización de una revisión bibliográfica junto con estudios de homología han permitidoidentificar más de 100 genes potencialmente implicados en la formación de biofilms en Anabaena sp. PCC7120. Además, se ha analizado mediante ensayos de retardo en gel (EMSA) la regulación de estos genes por parte de las proteínas FUR, lo que ha permitido identificar 54 genes directamente regulados por estas proteínas. Se pone así de manifiesto que las proteínas FUR juegan un papel clave en la regulación de la formación de biofilms en Anabaena sp. PCC7120.<br /

Estudios funcionales de la proteína FurB en Anabaena sp. PCC 7120

La proteína FurB pertenece a la familia Fur (ferric uptake regulator) de factores de transcripción, que regulan la homeostasis del hierro en Anabaena sp. PCC 7120 y otros microorganismos. En la cianobacteria coexisten tres parálogos de esta familia: FurA, que regula la homeostasis del hierro y es un regulador global de la transcripción; FurB, que modula también la homeostasis del zinc y se une de forma inespecífica al DNA para protegerlo del daño oxidativo y FurC, cuya transcripción se ve incrementada en condiciones de déficit de nitrógeno. El objetivo principal de este proyecto es aportar nuevos datos para dilucidar los procesos biológicos en los que interviene FurB en Anabaena sp. PCC 7120. Para ello, se ha realizado la caracterización fenotípica de un mutante de Anabaena sp. PCC 7120 con el gen furB delecionado y se ha obtenido un mutante sobreexpresando la proteína FurB, para su caracterización en futuros trabajos. Se ha estudiado también el nivel de expresión de la proteína en Anabaena sp. PCC 7120 bajo diferentes condiciones nutricionales y de estrés y su capacidad de unión in vitro a algunos promotores de genes implicados en la respuesta a estrés oxidativo. Los resultados obtenidos con el mutante de deleción de FurB sugieren la implicación de la proteína en la regulación transcripcional de genes que intervienen en la determinación de la morfología celular y en fotosíntesis y también que, la ausencia de FurB como proteína protectora en este mutante, podría llevar a la inducción de enzimas antioxidantes como la catalasa. Los estudios realizados con el mutante de sobreexpresión de FurB revelan que una mayor expresión de la proteína está ligada a una disminución en la expresión de FurA. Esto sugiere que FurB podría ejercer un efecto compensatorio para ciertas funciones de FurA. Los estudios de expresión de FurB en Anabaena sp. PCC 7120 muestran que su expresión aumenta bajo condiciones moderadas de estrés oxidativo causado por agua oxigenada pero disminuye en condiciones más extremas, seguramente debido a la destrucción de la proteína. Además, la expresión de la proteína aumenta en condiciones de iluminación alta y disminuye en condiciones de baja iluminación. En cambio, la expresión no se ve modificada bajo diferentes condiciones de disponibilidad de zinc, sugiriendo que una cantidad basal de proteína es suficiente para llevar a cabo su función reguladora. Por último, no se ha observado interacción de la proteína con los promotores de la Fe-SOD ni con el promotor de la glutation reductasa de Anabaena y, por lo tanto, no existiría una regulación directa de dichos genes por parte de FurB

Estudio funcional del motivo regulador de hemo en FurB (Zur) de Anabaena

Las proteínas Fur (ferric uptake regulator) son una superfamilia de reguladores transcripcionales presentes en la mayoría de los organismos procariotas. Tienen un papel clave en la regulación del metabolismo del hierro y otros metales como zinc, manganeso y níquel. También intervienen en la regulación de otros procesos celulares clave, como la defensa frente al estrés oxidativo, metabolismo del nitrógeno, la diferenciación de heterocistos en cianobacterias o la virulencia en algunos microorganismos patógenos La cianobacteria Anabaena sp. PCC 7120 contiene tres parálogos de la familia Fur: FurA, FurB y FurC. Este estudio se centra en la proteína FurB, que se ha descrito como el regulador Zur que controla la homeostasis del zinc y que también está implicada en la regulación de la respuesta a estrés oxidativo. Estudios anteriores demuestran el papel regulador del grupo hemo en la unión de FurB al DNA. Por ello, el objetivo de este trabajo consistió en estudiar la interacción de la proteína FurB con el grupo hemo y analizar la posible implicación del motivo Cys-Pro-Val en dicha interacción. Para ello, se construyó y purificó un mutante de la proteína, C93A, en el que la cisteína 93 fue reemplazada por alanina y se efectuó la caracterización bioquímica de la proteína obtenida para comprobar cómo afectaba dicha mutación a su actividad de unión al DNA y otras características bioquímicas relevantes. La mutación de la cisteína 93 alteró las características espectroscópicas del complejo proteína-hemo y disminuyó la afinidad de la proteína por el DNA. Por ello, la cisteína 93 parece estar implicada en la coordinación del grupo hemo o al menos localizada en una región próxima al sitio de coordinación

Papel de los reguladores transcripcionales Fur (Ferric Uptake Regulator) en la síntesis de exopolisacáridos y formación de biofilms en Anabaena sp. PCC7120

Las cianobacterias presentan un gran potencial como biofertilizantes debido a sus numerosas estrategias de adaptación, entre las que destaca la producción de biofilms. La matriz del biofilm protege a la cianobacteria y le permite crecer en condiciones hostiles, como deficiencia de nutrientes o altos niveles de salinidad, por lo que puede proliferar en suelos erosionados por la sobrecarga de actividades agrícolas y proveer un soporte para el crecimiento de otros microorganismos beneficiosos. Además, algunas cianobacterias como Anabaena contribuyen a la fertilización con el proceso de fijación biológica de nitrógeno. Trabajos preliminares llevados a cabo por el grupo de investigación en Regulación Génica y Fisiología de Cianobacterias de la Universidad de Zaragoza, sugieren que las tres proteínas de la familia de reguladores transcripcionales FUR (FurA, FurB y FurC) presentes en Anababena sp. PCC7120, pueden controlar algunos de los factores que influyen en la producción de biofilms en esta cianobacteria. En este trabajo se ha analizado el impacto de la desregulación de las proteínas FUR de Anabaena en la producción de biofilms en diferentes condiciones de estrés. Para ello se ha estudiado cómo afecta la deficiencia de nitrógeno y altos niveles de salinidad a la producción de exopolisacáridos presentes en los sobrenadantes de cultivos de Anabaena y como se ven afectadas otras características como su metabolismo, crecimiento y morfología. Además, se han seleccionado un conjunto de genes relacionados con la síntesis de exopolisacáridos y se ha evaluado su posible regulación por FurA y FurC mediante ensayos de cambio en la migración electroforética (EMSA). Estos genes fueron escogidos con base en resultados previos de q-RT-PCR en los que se observó un alto nivel de expresión en condiciones de deficiencia de nitrógeno. Un total de seis glicosiltransferasas fueron evaluadas como dianas potenciales de FUR, la presencia de Fur boxes para FurA y FurC confirmó estos resultados. Adicionalmente, se cuantificó en sobrenadante la cantidad de exopolisacárido producido por la estirpe silvestre de Anabaena sp. PCC7120 y sus variantes de sobreexpresión AG2770FurA, VCS2770FurB y EB2770FurC en deficiencia de nitrógeno y en 300 mM de NaCl. Así mismo se evaluó la capacidad de estas cepas para producir biofilms. Finalmente, se estudió la capacidad protectora de los exopolisacáridos obtenidos del sobrenadante de Anabaena sp. PCC7120 en la germinación de semillas de arroz (Oryza sativa) de la variedad Ariete, sometiendo las semillas durante su germinación en placas de Petri a condiciones de estrés salino (100 mM de NaCl). Los resultados sugieren que FurA y FurC están relacionados con el control de la expresión de genes implicados en la formación de biofilms en Anabaena. <br /