PI3 kinase is important for Ras, MEK and Erk activation of Epo-stimulated human erythroid progenitors

BACKGROUND: Erythropoietin is a multifunctional cytokine which regulates the number of erythrocytes circulating in mammalian blood. This is crucial in order to maintain an appropriate oxygen supply throughout the body. Stimulation of primary human erythroid progenitors (PEPs) with erythropoietin (Epo) leads to the activation of the mitogenic kinases (MEKs and Erks). How this is accomplished mechanistically remained unclear. RESULTS: Biochemical studies with human cord blood-derived PEPs now show that Ras and the class Ib enzyme of the phosphatidylinositol-3 kinase (PI3K) family, PI3K gamma, are activated in response to minimal Epo concentrations. Surprisingly, three structurally different PI3K inhibitors block Ras, MEK and Erk activation in PEPs by Epo. Furthermore, Erk activation in PEPs is insensitive to the inhibition of Raf kinases but suppressed upon PKC inhibition. In contrast, Erk activation induced by stem cell factor, which activates c-Kit in the same cells, is sensitive to Raf inhibition and insensitive to PI3K and PKC inhibitors. CONCLUSIONS: These unexpected findings contrast with previous results in human primary cells using Epo at supraphysiological concentrations and open new doors to eventually understanding how low Epo concentrations mediate the moderate proliferation of erythroid progenitors under homeostatic blood oxygen levels. They indicate that the basal activation of MEKs and Erks in PEPs by minimal concentrations of Epo does not occur through the classical cascade Shc/Grb2/Sos/Ras/Raf/MEK/Erk. Instead, MEKs and Erks are signal mediators of PI3K, probably the recently described PI3K gamma, through a Raf-independent signaling pathway which requires PKC activity. It is likely that higher concentrations of Epo that are induced by hypoxia, for example, following blood loss, lead to additional mitogenic signals which greatly accelerate erythroid progenitor proliferation

Hypoxia enhances human B19 erythrovirus gene expression in primary erythroid cells

AbstractHuman B19 erythrovirus replicates in erythroid progenitors present in bone marrow and fetal tissues where partial oxygen tension is low. Here we show that infected human primary erythroid progenitor cells exposed to hypoxia (1% O2) in vitro increase viral capsid protein synthesis, virus replication, and virus production. Hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1), the main transcription factor involved in the cellular response to reduced oxygenation, is shown to bind an HIF binding site (HBS) located in the distal part of the B19 promoter region, but the precise mechanism involved in the oxygen-sensitive upregulation of viral gene expression remains to be elucidated

Expansion

L'expansion des cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente une étape essentielle pour l'amélioration des greffes de moelle osseuse et le développement de nouveaux protocoles de thérapie cellulaire. L'utilisation de transferts de gènes codant des facteurs de transcription est une des voies pouvant mener à une expansion cellulaire efficace. Parmi ces facteurs, l'homéoprotéine HOXB4 est particulièrement intéressante car elle permet l'expansion très importante des CSH de souris, sans induire de leucémie même à long terme. Cependant, pour éviter tout effet délétère en rapport avec le transfert stable et la transcription constitutive du gène HOXB4 dans les cellules, nous avons utilisé la propriété des homéoprotéines à traverser passivement les membranes. Nous avons montré que les CSH et les progéniteurs hématopoïétiques immatures étaient nettement amplifiées, quand ces cellules étaient co-cultivées avec une lignée cellulaire stromale génétiquement modifiée pour secréter activement HOXB4. Le caractère pluripotent des cellules ainsi amplifiées était préservé. Nous avons testé, dans un modèle comparable, le rôle de HOXB4 sur l'expansion des progéniteurs lymphoïdes : nous avons montré que les progéniteurs immatures lympho-myéloïdes et pro-T/NK ainsi que les progéniteurs NK plus matures étaient clairement amplifiés. Nous avons aussi recherché une éventuelle activité synergique entre HOXB4 et d'autres homéoprotéines telles que HOXC4. Nous avons montré que HOXC4 était capable d'induire l'expansion des progéniteurs hématopoïétiques humain in vitro de façon comparable à HOXB4. La présence simultanée des deux homéoprotéines dans les co-cultures provoquait une expansion encore plus élevée qu'avec chacune d'entre elles. Notre méthode constitue donc une base pour le développement de nouvelles stratégies en thérapie cellulaire, par l'utilisation de cellules souches amplifiées in vitro mais non modifiées génétiquement

Etude du rôle des régulateurs Post-transcriptionnels Pumilio dans les cellules souches hématopoïétiques humaines

Des mises au point de nouvelles stratégies d expansion ex vivo des cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont développées depuis quelques années afin de pallier le problème du faible nombre de ces cellules pour le traitement des hémopathies ou de certaines tumeurs solides. Notre équipe avait établi un modèle d expansion des CSH via leur exposition aux homéoprotéines HOXB4 ou HOXC4. L étude comparative des transcriptomes de ces cellules a permis l identification de cibles précoces des facteurs HOXB4/C4 parmi lesquels les gènes codant les régulateurs post-transcriptionnels Pumilio (de la famille PUF). Les facteurs PUF sont impliqués en particulier dans le maintien des cellules souches germinales dans différents modèles animaux, chez les vertébrés ou les invertébrés. Cependant, le rôle des facteurs PUF humains (hPum1 et hPum2) dans les cellules hématopoïétiques humaines n avait jamais été étudié.Mon travail de thèse exposé ici a consisté, d une part, en l étude du profil d expression des facteurs hPum1 et hPum2 dans différentes lignées hématopoïétiques et au cours de l hématopoïèse humaine, démontrant une expression plus importante de ces gènes dans les cellules les plus immatures ainsi que dans les progéniteurs dont la prolifération est activée. D autre part, l étude fonctionnelle des facteurs hPum1 et hPum2 a mis en évidence leur implication dans l expansion et la survie des cellules CD34+. L inhibition spécifique de hPum1 ou de hPum2 in vitro par des shARN, induit une diminution significative du nombre absolu des cellules ainsi qu une augmentation de leur apoptose. Cela corrèle avec une accumulation des CSH en phase G0-G1 du cycle cellulaire. Par ailleurs, la répression de l expression de hPum1 ou de hPum2 diminue la reconstitution de l hématopoïèse in vivo dans des souris immunodéficientes NOD-SCID-gC-/-. L analyse des ARNm cibles des facteurs Pum par une étude comparative des transcriptomes des CSH transduites ou non par des vecteurs lentiviraux contenant des shARN hPum1 ou hPum2, a permis l identification de nombreux gènes impliqués dans le contrôle de la croissance, de la survie ou du cycle cellulaire. L ensemble de nos résultats montre l indispensable implication des facteurs Pumilio dans le maintien de l état souche, la prolifération et la survie des CSH humaines. Nous avons démarré des études fonctionnelles dans les cellules leucémiques myéloïdes primaires afin d évaluer le rôle éventuel des facteurs Pumilio dans la leucémogenèse. Ultérieurement, la caractérisation de hPum1 et hPum2 comme de nouvelles molécules impliquées dans l expansion des CSH permettra d envisager leur étude dans la perspective de nouvelles stratégies thérapeutiques.Ex vivo expansion of hematopoietic stem cells (HSCs) could improve new therapeutic strategies for the treatment of hematopoietic malignancies and solid tumors. Our team had developed an original method to expand human HSCs, consisting in the transfer into these cells of active HOXB4 or HOXC4 homeoproteins. The comparative transcriptomic analysis of CD34+ cells exposed or not to HOXB4 or HOXC4 proteins induced over-expression of Pumilio (PUF) genes. PUF proteins are post-transcriptional regulators of gene expression. They are involved in different biological functions among which the maintenance of stem cells. However, the function of human PUF factors (hPum1 and hPum2) in hematopoietic stem cells has never been investigated. The work that I developed during my thesis first consisted in analyzing the expression of PUF factors in different hematopoietic cell lines and during human hematopoiesis. The results highlighted a high expression of the hPum1 en hPum2 genes in the most immature cells and in the proliferating active progenitors. The study of human PUF factors by inducing their inhibition using specific shRNAs revealed their involvement in proliferation and survival of CD34+ cells. In vitro, inhibition of hPum1 or hPum2 decreases the expansion of human HSCs and increases cell apoptosis. The hPum1 or hPum2 repression also increases the number of HSCs in G0-G1 phase of the cell cycle. Moreover, the inhibition of hPum1 or hPum2 reduces the capacity of human HSCs to reconstitute in vivo hematopoiesis of immunodeficient NOD-SCID-gC-/- mice. The identification of PUF target mRNAs by a comparative transcriptomic analysis of human HSCs infected or not with lentiviral vectors containing hPum1/2 shRNAs, revealed a large number of genes involved in the regulation of cell growth, survival or cell cycle. On the whole, our results demonstrate the involvement of Pumilio factors in stemness maintenance, expansion and survival of human HSCs. Functional studies in primary myeloid leukemic cells are in progress to assess the potential role of the Pum factors in the leukemogenic process. Later on, identification of Pumilio factors as new regulators of HSCs expansion will allow consider them as new tools for therapeutic perspectives.PARIS5-Bibliotheque electronique (751069902) / SudocSudocFranceF

Efficient in vitro myogenic reprogramming of human primary mesenchymal stem cells and endothelial cells by Myf5

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The HOXB4 Homeoprotein Differentially Promotes Ex Vivo Expansion of Early Human Lymphoid Progenitors

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